系膜增生性腎炎T細(xì)胞免疫失衡及鹽酸青藤堿單體的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景: 在腎臟疾病如腎小球腎炎、小管間質(zhì)性腎炎及同種異體移植物排斥反應(yīng)的炎癥反應(yīng)中，T細(xì)胞在對(duì)腎臟免疫性損傷中占主導(dǎo)作用。T細(xì)胞的活化不僅需要MHC-肽-TCR方式提供第一信號(hào)，還需要共刺激分子提供第二信號(hào)。如果沒(méi)有足夠的共刺激信號(hào)刺激，T細(xì)胞表現(xiàn)為失能、耐受和凋亡。程序性死亡1共刺激分子(programmed death gene1，PD-1)/PD-L(PD-1 ligand)途徑是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激信號(hào)，屬CD28/B7

2、超家族成員。已證實(shí)該信號(hào)途徑的異常表達(dá)參與了自身免疫性疾病、同種異體移植物排斥反應(yīng)及各種感染的發(fā)生及進(jìn)展。目前針對(duì)共刺激信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)已經(jīng)成為免疫治療的新方法。 T細(xì)胞對(duì)疾病的影響不僅體現(xiàn)在活化水平，還體現(xiàn)在選擇性分化水平。T-bet是新發(fā)現(xiàn)的Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，GATA-3是Th2特異的轉(zhuǎn)錄因子，在Th2細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體免疫功能異常時(shí)，Th0細(xì)胞分化的Th1和Th2細(xì)胞亞群

3、比例及功能失衡，出現(xiàn)相應(yīng)的Th1和Th2漂移性疾病。研究顯示T-bet/GATA-3比值能較準(zhǔn)確地反映Th1/Th2細(xì)胞亞群的平衡狀態(tài)，可用于評(píng)價(jià)慢性腎炎的免疫平衡狀態(tài)。通過(guò)調(diào)節(jié)T-bet/GATA-3而恢復(fù)Th1/Th2的平衡，被認(rèn)為是自身免疫性疾病的一個(gè)可能的治療方向。 鹽酸青藤堿(sinomenine，SN)是從中藥青風(fēng)藤(Sinomeluum scutum Rehd et wils)中提取的生物堿單體，為新型中藥免疫調(diào)節(jié)

4、藥物，療效較好副作用小，用于慢性腎炎的治療已有10多年的成功經(jīng)驗(yàn)，但其具體機(jī)制依然不清。 本研究以常見(jiàn)的非IgA系膜增生性腎炎(mesangial proliferative nephritis，MsPGN)為觀察對(duì)象(避免不同病理類型對(duì)結(jié)果的影響)，觀察這類患者體內(nèi)PD-1/PD-L表達(dá)以及Th1/Th2平衡狀態(tài)有何變化；并從臨床的角度，前瞻性地觀察SN對(duì)MsPGN患者蛋白尿等臨床癥狀的影響，觀察SN對(duì)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(p

5、eripheral bloodmononuclear cell，PBMC) PD-1/PD-L、T-bet/GATA-3及Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以探討SN治療MsPGN的免疫機(jī)制，為應(yīng)用SN治療MsPGN提供理論依據(jù)。 1.研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)觀察MsPGN患者25例，另觀察10例正常人作為對(duì)照。其中腎組織標(biāo)本，MsPGN組標(biāo)本來(lái)自25例MsPGN患者的腎活檢標(biāo)本，對(duì)照組標(biāo)本10例來(lái)自親屬供腎的移植前腎活檢標(biāo)本和因

6、腎腫瘤而切除的遠(yuǎn)離腫瘤端且經(jīng)光鏡證實(shí)正常的腎組織標(biāo)本。 2.實(shí)驗(yàn)方法 (1)免疫組化檢測(cè)治療前MsPGN患者腎組織和對(duì)照組腎組織中PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白的表達(dá)；定量RT-PCR和多色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)治療前MsPGN患者和對(duì)照組PBMC PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表達(dá)。以了解MsPGN患者是否存在共刺激信號(hào)PD-1/PD-L的異常表達(dá)。 (2)免疫組化檢測(cè)治療前MsPGN患者腎組

7、織和對(duì)照組腎組織中T-bet、GATA-3蛋白的表達(dá)；定量RT-PCR檢測(cè)治療前MsPGN患者和對(duì)照組PBMC T-bet、GATA-3mRNA表達(dá)；同時(shí)采用ELISA法測(cè)定治療前MsPGN患者和對(duì)照組血清IFN-γ、IL-4、IL-10表達(dá)水平。以了解MsPGN患者在T細(xì)胞選擇性分化水平是否存在Thl/Th2失衡。 (3)采用定量RT-PCR和多色流式細(xì)胞技術(shù)觀察不同濃度SN(50μg/ml-200μg/ml)對(duì)體外培養(yǎng)的Ms

8、PGN患者外周血淋巴細(xì)胞PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。 (4)采用定量RT-PCR和Westem Blot方法觀察不同濃度SN(50μg/ml-200μg/ml)對(duì)體外培養(yǎng)的MsPGN患者外周血淋巴細(xì)胞T-bet、GATA-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；同時(shí)采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-10表達(dá)變化。 (5)留取對(duì)照組和治療前后MsPGN患者血、尿標(biāo)本，分別進(jìn)行臨

9、床生化及尿蛋白檢測(cè)，以觀察SN治療MsPGN的臨床療效。 (6)采用定量RT-PCR和多色流式細(xì)胞技術(shù)觀察MsPGN患者接受SN治療1月、3月后PBMC PD-1、PD-L1、PD-L2 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 (7)采用定量RT-PCR觀察MsPGN患者接受SN治療1月、3月后PBMC T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)的變化；同時(shí)采用ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4、IL-10表達(dá)變化。 結(jié)果

10、: 1.MsPGN患者腎活檢標(biāo)本腎小管間質(zhì)部位的淋巴細(xì)胞有PD-1陽(yáng)性表達(dá)，而PD-L1表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells、TEC)，腎小球無(wú)PD-1、PD-L1表達(dá)。對(duì)照組腎組織中無(wú)PD-1表達(dá)，PD-L1表達(dá)很少甚至無(wú)表達(dá)。兩組腎組織標(biāo)本中均未檢測(cè)到PD-L2表達(dá)。MsPGN患者PBMC PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而PD-L2蛋白在MsPGN患者和對(duì)照

11、組中表達(dá)很少，兩組間無(wú)顯著差異。 2.在TEC和腎間質(zhì)滲出的淋巴細(xì)胞檢測(cè)到T-bet、GATA-3的陽(yáng)性表達(dá)，MsPGN腎組織T-bet表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組而GATA-3表達(dá)弱于對(duì)照組；MsPGN患者PBMC T-betmRNA表達(dá)高于對(duì)照組，而GATA-3 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組；MsPGN患者血清IFN-水平高于對(duì)照人群，而IL-10水平低于對(duì)照人群。 3.體外實(shí)驗(yàn)觀察到SN可以抑制MsPGN患者外周血淋巴細(xì)胞PD-1、P

12、D-L1mRNA和蛋白表達(dá)，這種抑制作用隨著SN濃度的增加而增強(qiáng)。 4.體外實(shí)驗(yàn)觀察到SN可以抑制MsPGN患者外周血淋巴細(xì)胞T-bet mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)T-bet/GATA-3比值，并抑制Thl細(xì)胞因子IFN-y的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用隨著SN濃度的增加而增強(qiáng)。 5.SN治療可有效控制MsPGN患者蛋白尿，并升高補(bǔ)體C3水平，副作用小。 6.SN治療可以抑制MsPGN患者PBMC PD-1、PD-L1 mR

13、NA和蛋白表達(dá)，這種抑制作用隨著SN治療時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。 7.SN治療可以抑制MsPGN患者PBMC T-bet的mRNA表達(dá)，下調(diào)T-bet/GATA-3比值，并抑制Thl細(xì)胞因子IFN-丫的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用隨著SN治療時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。 結(jié)論: SN治療可有效控制輕、中度MsPGN患者蛋白尿，并升高補(bǔ)體C3水平，副作用小，但療程至少要1月以上才有明顯療效。 MsPGN患者腎組織和PBMC上PD-1

14、、PD-L1表達(dá)高于對(duì)照組，可能與MsPGN的免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)。SN可以抑制PD-1、PD-L1的病理性高表達(dá)，這種抑制作用隨著SN濃度的增加、治療時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，提示SN控制MsPGN患者蛋白尿的治療機(jī)制可能與抑制PD-1、PD-L1表達(dá)有關(guān)。 MsPGN患者在T細(xì)胞選擇性分化過(guò)程中，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平和細(xì)胞因子水平存在Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)，這可能是MsPGN的重要免疫發(fā)病機(jī)制。而SN能抑制MsPGN患者T-bet表達(dá)，下調(diào)T-bet