小鼠系膜增生性腎炎模型的建立及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、背景：包括 IgA腎病在內(nèi)的系膜增生性腎炎（ Mesangial Proliferative Glomerulo-nephritis, MesPGN）是一種免疫炎癥相關(guān)性疾病，是我國最常見的慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD），是導(dǎo)致慢性腎衰竭、尿毒癥的主要原發(fā)病。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，MAX作用因子1（MAX interactor1， Mxi1）在抗Thy1腎炎模型大鼠中存在明顯變化，主要表現(xiàn)為：在系膜

2、增殖期表達(dá)降低，增殖恢復(fù)期表達(dá)逐漸回升，提示這一因子在疾病病理過程中發(fā)揮作用。腎小球腎炎是一種自身免疫性疾病，主要與免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。在抗Thy1腎炎模型基因表達(dá)譜中，在模型建立早期多種免疫炎癥相關(guān)因子表達(dá)明顯增多，在模型恢復(fù)期表達(dá)恢復(fù)到正常水平，提示免疫炎癥相關(guān)因子與系膜增生性腎炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　目的：利用 Mxi1基因敲除小鼠（Mxi1-/-）和野生型小鼠（Mxi1+/+）建立小鼠系膜增生性腎炎模型，對比觀察不同

3、類型小鼠病理表型的變化，重點(diǎn)關(guān)注Mxi1基因缺失后模型的改變以及免疫炎癥因子的變化趨勢。而后利用RNAi技術(shù)在體外進(jìn)一步研究Mxi1基因缺失后影響系膜細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用尾靜脈注射竹葉青蛇毒素的方式利用 Mxi1基因敲除小鼠和野生型小鼠建立系膜增生性腎炎（Habu腎炎）模型，小鼠遺傳背景為：FVB/N。樣本取材時間點(diǎn)分別為模型建立的第0（Control），1，3，7和14天，血清樣本送至臨檢科進(jìn)行生化指

4、標(biāo)檢測；組織樣本利用 PAS染色觀察兩種基因型 Habu腎炎模型小鼠病理在各個時間點(diǎn)的病理表型同時進(jìn)行腎小球內(nèi)有核細(xì)胞計(jì)數(shù)；利用免疫組織化學(xué)染色方法對腎小球內(nèi)PCNA表達(dá)變化進(jìn)行對比觀察；利用Western blot法和TUNEL染色方法檢測腎組織內(nèi)細(xì)胞凋亡水平；利用定量PCR和Western blot法檢測相關(guān)免疫炎癥因子CXCL10的表達(dá)，同時利用免疫組織化學(xué)染色法對 CXCL10的表達(dá)在腎組織內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行定位；利用Western

5、blot法檢測調(diào)控CXCL10表達(dá)的信號通路TLR4-IRF3相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　2.利用RNAi技術(shù)在體外干預(yù)小鼠系膜細(xì)胞Mxi1基因表達(dá)，觀察Mxi1基因缺失后免疫炎癥相關(guān)因子CXCL10表達(dá)變化以及細(xì)胞生存的影響。
　　3.利用小鼠抗CXCL10抗體中和Mxi1基因失活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CXCL10后，觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　4.利用RNAi技術(shù)干擾IRF3表達(dá)，觀察TLR4-IRF3通路被抑制后CXCL10表達(dá)

6、變化以及細(xì)胞生存的影響。
　　5.采用尾靜脈注射竹葉青蛇毒素的方式建立不同遺傳背景小鼠系膜增生性腎炎模型，兩種小鼠品系分別為：C57BL/6和FVB/N。病理取材時間點(diǎn)分別為模型建立的第0，1，3，7，14和21天，對比觀察各時間點(diǎn)的病理變化及生化指標(biāo)；利用Western blot法和TUNEL染色法檢測腎組織內(nèi)細(xì)胞凋亡水平；利用免疫組織化學(xué)染色方法對腎小球內(nèi)PCNA表達(dá)變化進(jìn)行對比觀察。
　　結(jié)果：
　　1.對 Mx

7、i1基因敲除小鼠和野生型小鼠 Habu腎炎模型組小鼠進(jìn)行對比觀察發(fā)現(xiàn)：FVB/N野生型小鼠（Mxi1+/+）和基因敲除小鼠（Mxi1-/-）存活率基本一樣；生化指標(biāo)檢測結(jié)果提示兩種小鼠均沒有出現(xiàn)腎功能異常；在病理表型方面，Mxi1+/+模型小鼠在模型建立早期系膜溶解病變較輕且不典型，而Mxi1-/-小鼠則呈現(xiàn)典型的系膜溶解表型，腎小球內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組小鼠，活化的caspase3表達(dá)增高以及TUNEL染色結(jié)果提示Mxi1-/-H

8、abu腎炎模型小鼠腎組織細(xì)胞凋亡水平高；在系膜細(xì)胞增殖的高峰期兩種基因型小鼠的病理表型沒有明顯差異；對兩種小鼠免疫炎癥相關(guān)因子CXCL10的檢測發(fā)現(xiàn)這因子在兩種小鼠腎組織內(nèi)呈現(xiàn)不同的變化趨勢；Mxi1-/-小鼠腎臟內(nèi)TLR4-IRF3通路活化。
　　2.體外采用 RNAi技術(shù)干擾小鼠系膜細(xì)胞內(nèi) Mxi1的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡比例明顯上升，CXCL10表達(dá)明顯升高，Mxi1失活誘導(dǎo)了CXCL10表達(dá)；RNAi干擾Mxi1的同時利用抗小鼠

9、CXCL10抗體中和細(xì)胞內(nèi)的CXCL10可以降低活化的 caspase3的表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)；RNAi同時干擾 Mxi1和 IRF3后CXCL10表達(dá)減少，凋亡細(xì)胞減少。
　　3.對兩種遺傳背景 Habu腎炎模型小鼠進(jìn)行對比觀察發(fā)現(xiàn)：C57BL/6小鼠表現(xiàn)出典型的系膜溶解病變，同時小鼠存活率明顯優(yōu)于FVB/N小鼠，凋亡檢測結(jié)果顯示C57BL/6模型小鼠腎組織內(nèi)凋亡水平高于FVB/N小鼠，而FVB/N模型小鼠呈現(xiàn)不典型的系膜溶解表

10、型；在增殖期C57BL/6模型小鼠系膜細(xì)胞增殖程度高于FVB/N模型小鼠，細(xì)胞增殖高峰均在模型建立的第7天，C57BL/6模型小鼠細(xì)胞增殖持續(xù)至模型建立的第14天；在免疫驗(yàn)證相關(guān)因子表達(dá)方面C57BL/6模型小鼠腎組織內(nèi)CCL2和CXCL10表達(dá)水平高于FVB/N模型小鼠；生化指標(biāo)檢測結(jié)果提示兩種小鼠均沒有出現(xiàn)腎功能異常。
　　結(jié)論：
　　1. Mxi1-/-小鼠系膜增生性腎炎病理表型較野生型小鼠更典型更重，凋亡細(xì)胞比例較高