應(yīng)用噬菌體隨機肽庫技術(shù)研究干擾素-α2b的模擬肽和拮抗肽.pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是一類重要的細胞因子，作為抗病毒和抗腫瘤的藥物已廣泛用于臨床。IFN通過與靶細胞表面的受體結(jié)合后，激活信號通路，誘導(dǎo)相關(guān)抗病毒、抗腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄和表達，發(fā)揮其生物學(xué)作用。而蛋白質(zhì)之間的相互作用或識別是通過局部肽段間的少量氨基酸殘基相互作用來實現(xiàn)的，合理設(shè)計的小肽可以完全或部分模擬完整蛋白分子的功能。通常完整的蛋白分子由于對蛋白酶敏感、具有宿主免疫原性以及成本高等原因并不是最佳的候選藥物。IFN除了具

2、有以上不足外，在臨床使用時還會出現(xiàn)副作用，限制了其使用。而小分子肽類細胞因子模擬物或拮抗劑由于其相對分子質(zhì)量小、易于合成、無抗原性和毒副作用較小等特點，在基礎(chǔ)研究以及臨床治療等領(lǐng)域逐漸顯現(xiàn)出其優(yōu)勢。本論文以IFN-α2b為研究對象，以Anti-IFN-α2b多克隆抗體、天然表達IFN受體的細胞為靶標，利用噬菌體隨機肽庫技術(shù)，研究IFN-α2b的抗原表位、篩選IFN-α2b的拮抗肽和模擬肽，對研究IFN的分子機制以及設(shè)計和開發(fā)IFN小分子

3、模擬肽藥物有重要的意義。 本文首先以結(jié)合有Anti-IFN-α2b多克隆抗體的免疫磁性微球為靶標，篩選噬菌體隨機12肽庫。經(jīng)ELISA鑒定，四輪篩選后同抗體結(jié)合的噬菌體得到明顯的富集，其陽性率達到53％(49/92)。隨機挑取12個陽性噬菌體進行序列分析并與IFN-α2b序列進行同源比對。結(jié)果顯示：12個陽性克隆可分為三組，分別對應(yīng)IFN-α2bN端(1～13)、AB環(huán)附近(35～47)和CD環(huán)附近(98～110)的三組高抗原性

4、表位區(qū)，與IFN抗原預(yù)測分析的數(shù)據(jù)相吻合。特異性抗體封閉試驗和噬菌體免疫試驗表明，所得到的噬菌體展示肽在免疫反應(yīng)性和免疫原性上均可以一定程度地模擬IFN-α2b不同的表位區(qū)。結(jié)合IFN的三維結(jié)構(gòu)進行分析，三組模擬表位均暴露在IFN分子結(jié)構(gòu)的外部，更容易被抗原呈遞細胞上的抗原識別受體所識別。其中第二組表位AB環(huán)(29～35)直接參與與IFN受體的結(jié)合，推測在使用IFN治療疾病過程中，針對該區(qū)域所產(chǎn)生的中和抗體可能直接影響IFN的生物學(xué)活性

5、。 采用基因重組技術(shù)，本文成功構(gòu)建了原核表達載體pET32a(+)/GFP-IFN-α2b，并在大腸桿菌E.coliBL21中成功地進行了表達。SDS-PAGE和Westernblot實驗顯示該融合蛋白GFP-IFN-α2b保持了良好的IFN抗原性；受體結(jié)合實驗表明，該融合蛋白能夠與WISH細胞上的IFN受體結(jié)合，并在488nm激發(fā)光下呈現(xiàn)亮綠色熒光；抗病毒實驗表明，該融合蛋白具有一定的抗病毒活性，比活力為1.0×107IU/m

6、g，證明該融合蛋白為具有綠色熒光和IFN抗病毒活性的雙功能蛋白。本研究為在細胞及分子水平研究IFN與靶細胞相互作用提供了簡便、快捷、直觀的研究材料，同時也為IFN的代謝及功能研究建立了方法學(xué)基礎(chǔ)。 以天然表達IFN受體的WISH細胞并結(jié)合Anti-IFN-α2b多克隆抗體為靶分子，本文采用競爭性洗脫的方法篩選噬菌體隨機7肽庫。經(jīng)鑒定六輪篩選后同細胞和抗體結(jié)合的噬菌體得到明顯的富集，最后一輪篩選的陽性率達到51.1％(23/45)

7、。隨機挑取10個陽性克隆進行序列分析并與IFN序列進行同源比對。結(jié)果顯示：10個克隆可分為三組，分別對應(yīng)IFNAB環(huán)的24～41和43～49以及E螺旋的148～158位氨基酸殘基。分別選取對應(yīng)AB環(huán)的第一組的No.26，以及E螺旋第三組的No.35兩個噬菌體克隆為例做進一步研究。競爭性ELISA和細胞免疫組化實驗顯示，No.26和No.35能與IFN競爭性的同IFN受體或抗體結(jié)合。以其展示的序列分別合成SP-7(SLSPGLP)和FY-

8、7(FSAPVRY)兩個小肽。細胞受體競爭實驗顯示，SP-7和FY-7能夠有效地模擬IFN的部分受體結(jié)合表位，特異性地抑制IFN與其受體的結(jié)合，其IC50值分別為8.90μg和3.22μg。采用細胞病變抑制法分析SP-7和FY-7對IFN抗病毒活性的影響，結(jié)果顯示當(dāng)兩個合成肽的加入量在6.25～100μg之間時，合成肽對IFN抗病毒活性均具有抑制作用，并且存在劑量依賴關(guān)系，其IC50約為25μg，證明SP-7和FY-7為兩個IFN拮抗肽

9、。 為了得到具有抗病毒活性的IFN模擬肽，本文在上述細胞篩選的基礎(chǔ)上，對上述同細胞結(jié)合的噬菌體，又增加了三輪功能篩選。經(jīng)鑒定具有抗病毒活性的噬菌體克隆得到了一定的富集，其陽性率為1.98％(20/1012)。隨機挑取10個陽性克隆進行序列分析并與IFN-α2b的序列進行比對。結(jié)果顯示：10個克隆可分為四組，分別對應(yīng)IFN的31～37、68～74、93～121和132～161位氨基酸殘基。其中第一組的No.T9(31～37)與IF

10、N中AB環(huán)(26～35)有部分重疊；第四組中的No.T3(143～149)與IFN中E螺旋(141～158)有部分重疊，并且其序列中144R和149R與IFN分子中參與受體結(jié)合并激活信號通路的“熱點”氨基酸一致。競爭ELISA和細胞免疫組化實驗顯示，No.T9和No.T3能與IFN競爭性的同IFN受體結(jié)合。以其展示的序列分別合成KP-7(NVHPP)和IR-7(IRPDTPR)兩個小肽。細胞受體競爭實驗顯示，KP-7和IR-7能有效地模

11、擬IFN的部分受體結(jié)合表位，特異性地抑制IFN與其受體的結(jié)合，其IC50值分別為13.43μg和9.49μg。細胞病變抑制法的抗病毒實驗表明：KP-7和IR-7在1.25～5μg范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一定的抗病毒活性，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，證明KP-7和IR-7為兩個模擬IFN不同表位具有抗病毒作用的模擬肽。其中KP-7抗病毒活性略高于IR-7，并在發(fā)揮抗病毒作用時兩者呈現(xiàn)出一定的協(xié)同作用，提示IFN的抗病毒作用是多位點共同作用其受體的結(jié)果。