用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選hCD81模擬小肽.pdf

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染引起的一種世界性傳染病，目前全球HCV感染者近1億7千萬(wàn)。HCV急性感染后約40-60％以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分病人可發(fā)展為肝硬化或肝癌。迄今為止，對(duì)HCV慢性感染尚無(wú)高效的特異性治療方法。 HCV屬于黃病毒家族，是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.5kb，有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，可翻譯成一個(gè)約3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，該前體蛋白在宿主信號(hào)肽酶和

2、病毒自身蛋白酶的加工下，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白(C，E1，E2，)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B等)。 HCV的包膜糖蛋白E2分布于病毒顆粒表面，可能與病毒和宿主間免疫應(yīng)答及介導(dǎo)病毒進(jìn)人靶細(xì)胞等過(guò)程密切相關(guān)，因此成為預(yù)防HCV感染研究中的主要角色。E2蛋白能與肝細(xì)胞表面的多種分子結(jié)合，其中，人CD81分子(hCD81)己被公認(rèn)為是HCV的重要受體。雖然CD81介導(dǎo)HCV感染的機(jī)制尚不清楚，但是體

3、外試驗(yàn)表明，CD81分子是HCV感染原代肝細(xì)胞以及肝源性腫瘤細(xì)胞所必需的。因此，靶向人CD81的模擬分子對(duì)于HCV感染的治療有著應(yīng)用前景，這也是目前HCV治療藥物領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)了HCVE2蛋白和在大腸桿菌中表達(dá)了人CD81分子大胞外環(huán)。再以hCD81單抗為配基，從噬菌體12肽庫(kù)中篩選hCD81模擬小肽，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明能競(jìng)爭(zhēng)抑制HCVE2和hCD81的結(jié)合。第一部分HCV包膜E2蛋

4、白和人CD81分子大胞外環(huán)的表達(dá)及HCV假病毒的構(gòu)建 用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)分泌表達(dá)HCV包膜E2蛋白。首先根據(jù)1b基因型HCV包膜E2蛋白編碼基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，以聚合酶反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HCV包膜E2蛋白外段基因；將neo基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo的內(nèi)含子基因的剪切供體與剪切受體位點(diǎn)之間，而將HCV包膜E2蛋白基因置于neo基因內(nèi)含子的3’端，構(gòu)建了新型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體pCIDA-neo-

5、E2。該質(zhì)粒載體利用真核啟動(dòng)子高水平調(diào)控HCV包膜E2基因的表達(dá)，借助于內(nèi)含子的剪切功能篩選用的標(biāo)記基因(neo)僅低水平表達(dá)。以表達(dá)質(zhì)粒pCIDA-neo-E2轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，因neo為G418的標(biāo)志基因，以G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。將篩選的標(biāo)記基因neo插入人珠蛋白內(nèi)含子中，因內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中被切除，因而不影響目的基因的表達(dá)。有報(bào)道，與常規(guī)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒相比，該質(zhì)粒中的篩選基因顯著降低。用一定濃度的G418

6、篩選時(shí)，細(xì)胞能抵抗的G418濃度與細(xì)胞內(nèi)neo基因表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)成正比，因此，通過(guò)G418篩選，只有染色體中高拷貝整合質(zhì)粒編碼的細(xì)胞才能存活，而存活的細(xì)胞則能高水平表達(dá)質(zhì)粒編碼的目的基因-HCV包膜E2蛋白。將培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮，濃縮液進(jìn)行westernblot檢測(cè)，E2抗體為山羊抗HCV包膜E2蛋白多抗，結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞裂解液中存在各種不同分子量形式的E2蛋白，最高分子量的蛋白為完全糖基化E2，而其余為部分糖基化E2。細(xì)胞培養(yǎng)上清用抗

7、E2單克隆抗體進(jìn)行dotblot檢測(cè)，也能檢測(cè)到分泌在上清中的E2蛋白。 以克隆有人CD81cDNA的質(zhì)粒pMD18-hCD81為模板，PCR擴(kuò)增CD81LELcDNA，插入原核表達(dá)載體pET32a，得到的重組質(zhì)粒pET32a-CD81LEL編碼硫氧還蛋白和人CD81分子融合蛋白。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，該重組菌可表達(dá)分子量約28kD的重組蛋白，與目的蛋白分子量相似，并且，重組蛋白主要以可溶性形式存在。Westernblot分析證明，融

8、合蛋白具有人CD81LEL抗原性。用Ni-NTA純化可得到純度較好的融合蛋白。通過(guò)ELISA檢測(cè)，所表達(dá)的HCVE2蛋白可以和CD81胞外環(huán)結(jié)合。 構(gòu)建HCV包膜E1-E2蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，與小鼠白血病病毒核心蛋白以及綠色熒光蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)上清感染人肝癌細(xì)胞Huh7.5，可觀察到Huh7.5細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)，流式分析檢測(cè)到細(xì)胞的感染率為0.2-0.9％。 第二部分人CD81樣

9、小肽的隨機(jī)肽庫(kù)篩選與活性鑒定以抗hCD81單抗為配基，對(duì)12肽庫(kù)進(jìn)行三輪篩選，把每次洗脫下來(lái)的噬菌體擴(kuò)增，純化，用作下一輪的篩選。取第三輪篩選的噬菌體鋪平板，一共隨機(jī)挑取了分隔良好的32個(gè)噬菌體陽(yáng)性克隆，分別擴(kuò)增純化后，分別以抗CD81單抗、HCVE2為抗原做ELISA檢測(cè)，最后選取3個(gè)親和力最高的陽(yáng)性克隆作DNA測(cè)序，氨基酸序列都符合隨機(jī)12肽庫(kù)的序列，查找GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與CD81均不具有同源性。初步可以推斷，所篩

10、選的小肽可能只是模擬hCD81的活性序列。以HCVE2蛋白包被酶標(biāo)板，分析噬菌體陽(yáng)性克隆對(duì)HCVE2蛋白與CD81結(jié)合的影響，結(jié)果可見(jiàn)，噬菌體能有效抑制HCVE2蛋白與人CD81的結(jié)合，表現(xiàn)出明顯的量效依賴關(guān)系。 小結(jié)1分別用CHO細(xì)胞和大腸桿菌成功表達(dá)了功能性HCV包膜E2蛋白和人CD81分子大胞外環(huán)，并構(gòu)建成功裝配有HCV包膜蛋白的HCV假病毒顆粒。為進(jìn)一步開(kāi)展抗HCV感染的小分子競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、HCV受體以及HCV疫苗的研究