噬菌體肽庫(kù)跨膜型TNF-α模擬肽的篩選及其體內(nèi)外生物學(xué)功能的研究.pdf

1、該研究以sTNFRI為釣餌,從噬菌體隨機(jī)環(huán)肽庫(kù)中篩選可模擬TM-TNF-α生物學(xué)活性的短肽,從而為研制類似TM-TNF-α抗瘤效應(yīng)的新型肽類藥物奠定基礎(chǔ).一、篩選模擬TM-TNF-α的噬菌體展示肽1.噬菌體肽庫(kù)的親和篩選:以sTNFRI為靶分子,對(duì)噬菌體隨機(jī)環(huán)肽庫(kù)進(jìn)行親和篩選.在篩選過(guò)程中,通過(guò)降低靶分子的濃度、減少靶分子與肽庫(kù)的作用時(shí)間、增加洗脫強(qiáng)度等方法,去除非結(jié)合和弱結(jié)合的噬菌體肽,經(jīng)三輪篩選后得到高度富集的、與TNFR具有高親和

2、力的特異性噬菌體克隆.2.用胞毒效應(yīng)篩選TM-TNF-α模擬肽:隨機(jī)挑取37個(gè)經(jīng)三輪篩選后的噬菌體克隆,分別觀察它們對(duì)sTNF-α敏感細(xì)胞株U937和耐受細(xì)胞株HL-60的胞毒效應(yīng).3.TM-TNF-α模擬肽氨基酸序列分析:從29個(gè)模擬TM-TNF-α以噬菌體克隆中選取9個(gè)克隆進(jìn)行噬菌體DNA測(cè)序,以此確定氨基酸序列.二、模擬TM-TNF-α噬菌體展示肽體外生物學(xué)活性;1.不同噬菌體展示肽致腫瘤細(xì)胞死亡方式的比較:該室的前期研究工作證實(shí)

3、:TM-TNF-α主要引起靶細(xì)胞的凋亡,而sTNF-α則主要引起靶細(xì)胞的壞死.將TNF和噬菌體展示肽作用于HepG2細(xì)胞3h后,用Annextin-V-FITC和PI對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色.2.不同噬菌體展示肽對(duì)SODDmRNA表達(dá)水平的影響:RT-PCR結(jié)果顯示:TM-TNF-α及其模擬噬菌體展示肽使U937細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的SODDmRNA表達(dá)水平增加(分別增加55.25﹪,47.67﹪和53.67﹪,48.15﹪),而sTN

4、F-α及其模擬噬菌體展示肽則無(wú)此作用.3.不同噬菌體展示肽對(duì)HL-60胞漿IκB水平的影響:Western-blotting結(jié)果顯示sTNF-α及其模擬噬菌體展示肽可使HL-60細(xì)胞胞漿IκB水平下降,而TM-TNF-α及其模擬噬菌體展示肽則無(wú)此作用.提示:sTNF-α模擬肽同sTNF-α一樣可明顯增強(qiáng)IκB的降解,從而促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位.三、模擬TM-TNF-α噬菌體展示肽體內(nèi)殺瘤效應(yīng)的比較;給肝癌負(fù)荷動(dòng)物注射不同劑量、不同模擬T

5、M-TNF-α噬菌體展示肽,結(jié)果顯示:兩個(gè)模擬TM-TNF-α作用的噬菌體展示肽在體內(nèi)均有顯著的殺瘤能力,其中31號(hào)噬菌體展示肽的抑瘤作用最強(qiáng),抑瘤率達(dá)76.7﹪,且其作用呈明顯的劑量依賴性. 綜上所述,用噬菌體展示技術(shù),我們篩選到TM-TNF-α模擬環(huán)肽,可模擬TM-TNF-α在體外殺傷sTNF-α耐受腫瘤細(xì)胞,引起腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)IκB無(wú)影響;在體內(nèi)可有效抑制腫瘤生長(zhǎng).從而為進(jìn)一步研制模擬TM-TNF-α的新型肽類藥物提供重要的線索