阿霉素誘導人膽管癌細胞系耐藥株的建立及其生物學特性評價.pdf

1、目的：多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化學治療的主要障礙，使得膽管癌的化學治療效果差，本研究擬在源于人的肝門部膽管 癌原發(fā)灶的膽管癌細胞系FRH-0201的基礎(chǔ)上建立膽管癌細胞阿霉素耐藥株 FRH一0201/Adm，并研究其生物學特性，為探討惡性腫瘤細胞對化療耐藥的 機制并且體外逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的新方法，克服當前化學治療腫瘤中存在的這 一主要障礙奠定一個研究的基礎(chǔ)平臺。 方法：選擇我們建

2、立并已經(jīng)傳代的原發(fā)肝門部膽管癌細胞系(FRH－0201)，已傳至第120代，細胞生長穩(wěn)定，用2μg/ml阿霉素 (adri amycin，ADM)間歇性作用誘導法逐漸篩選出耐藥細胞，最終建立了能在1μg/ml阿霉素濃度的培養(yǎng)液中生長并傳代的膽管癌細胞阿霉素耐藥株FRH-0201/Adm。以FRH-0201為對照，通過光鏡觀察細胞的形態(tài)變化，通 過MTT繪制生長曲線觀察細胞的生長規(guī)律和倍增時間；用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞的腫瘤標志物

3、CAl9-9和CAl25的變化情況；用MTT法檢測耐藥性即耐藥指數(shù)的改變；流式細胞術(shù)檢測細胞的周期分布的變化；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測了mdr1基因mRNA表達量。免疫組織化學抗體染色檢測細胞表面耐藥 基因(mdr1)的表達產(chǎn)物p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gP)表達。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)阿霉素藥物濃度的變化以觀察癌細胞的膜蛋白的功能變化情況。 結(jié)果：與FRH-0201細胞相比較，F(xiàn)RH-0201/Adm細胞的

4、形態(tài)沒有明顯的變化，倍增時間延長約3h；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢腫瘤標記物：耐藥株與原細胞系分別為：CA125為9.1 4u/ml，8.60u/ml；MTT法檢測耐藥性即耐藥指數(shù)，該細胞對阿霉素藥物耐藥，F(xiàn)RH-0201-Adm對阿霉素的耐藥指數(shù)是親本細胞的約8倍；流式細胞術(shù)檢測細胞的周期分布，S期細胞增多16.89％，G1期細胞減少29.33％、G2期細胞增多12.46％；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測，細胞的mdr1基因表達增加約10.295倍，細胞表

5、面的多藥耐藥蛋白p-gp的表達顯著增加；磁共振共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強度表示。然后計算平均值，親本細胞株FRH-0201和耐藥細胞株FRH-0201/ADM的熒光強度平均值分別為1764.8和305.4，相差5.2倍。 結(jié)論：FRH-0201/Adm細胞是源于原發(fā)灶的腫瘤細胞的耐藥細胞株，具有耐藥性，p-gp的過表達可能參與了細胞對阿霉素的耐藥，能夠用于膽管癌術(shù)后化療耐藥機制的探討，并可以進一步研究耐藥的逆轉(zhuǎn)