抗TNF-α小分子抑制劑的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和活性的初步測定.pdf

1、腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactorα，TNF-α)主要是由巨噬細(xì)胞分泌的一種多功能細(xì)胞因子，一方面它能殺傷某些腫瘤細(xì)胞或使體內(nèi)腫瘤組織發(fā)生出血性壞死；另一方面它又是一種較強(qiáng)的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，過量的TNF-α表達(dá)可以引起組織損傷、重癥感染性休克、自身免疫性疾病等，可以說TNF-α作為一個(gè)調(diào)節(jié)生理平衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在人類對抗腫瘤及其他疾病中扮演了“雙刃劍”的角色。依據(jù)TNF-α的雙重作用，本實(shí)驗(yàn)課題主要分為兩個(gè)部分，首

2、先完成了一類TNF-α小分子抑制劑的設(shè)計(jì)、篩選及活性測定，其次對抗CD20Fab-TNFα融合蛋白在B系淋巴瘤中的功能作用進(jìn)行了初步研究。 在過去的30年中，隨著對某些炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、銀屑病及強(qiáng)直性脊柱炎在細(xì)胞和分子水平上病理機(jī)理的闡明，人們發(fā)現(xiàn)這些疾病之間有著共同的發(fā)生機(jī)制。而由TNF-α及其受體所構(gòu)成的細(xì)胞因子信號通路網(wǎng)絡(luò)在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著核心作用。阻斷TNF-α活性已成為治療上述免疫性疾病的

3、主要手段。目前，國際上用于抗TNF-α治療用藥物主要有三種，皆為蛋白類藥物，這些生物大分子一方面具有特異性好、結(jié)合能力強(qiáng)的特點(diǎn)，但另一方面也存在著穩(wěn)定性較差，在患者體內(nèi)易降解并極易產(chǎn)生免疫耐受的缺點(diǎn)。因此，探索新的免疫抑制劑研究策略來研制靶向抗TNF-α的小分子藥物，已成為國內(nèi)當(dāng)前臨床免疫治療急需解決的難題之一。 本文利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer—aideddrugdesign，CADD)，以靶蛋白及其受體的復(fù)合晶體

4、結(jié)構(gòu)為模板，從小分子化合物庫中虛擬篩選出300-500個(gè)抗TNF-α的抑制劑，并購買其中的80個(gè)代表性化合物做進(jìn)一步的生物活性測定。包括初步的抑制TNF-α對L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞儀法測定篩選的小分子化合物阻斷量子點(diǎn)標(biāo)記的TNF-α結(jié)合受體的實(shí)驗(yàn)；MTT法進(jìn)一步分析篩選出的小分子化合物在不同劑量時(shí)抑制TNF-α對L929細(xì)胞毒性的作用；采用AnnexinV—FITC檢測上述小分子對TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用?；钚院Y選結(jié)果

5、顯示有3個(gè)小分子化合物對TNF-α有顯著抑制活性；對其中較好的一個(gè)進(jìn)行了深入研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該化合物能特異性阻斷量子點(diǎn)標(biāo)記的TNF-α與受體的結(jié)合，并呈劑量依賴性；該化合物具有較強(qiáng)的抑制TNF-α(1ng/ml)對L929細(xì)胞毒性的作用，表現(xiàn)為劑量依賴性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為10umol/L；該化合物能抑制TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)證明，利用以上計(jì)算機(jī)虛擬篩選并結(jié)合人工篩選及生物學(xué)活性檢測的方法能夠

6、發(fā)現(xiàn)針對特定靶點(diǎn)的小分子抑制劑。 盡管TNF-α在自身免疫性疾病中起到核心作用，但人們最初認(rèn)識它卻是作為一個(gè)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死的細(xì)胞因子。體外實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α具有很強(qiáng)的抗增殖功能和細(xì)胞毒性。因此，在上個(gè)世紀(jì)80年代就被應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療當(dāng)中。但全身系統(tǒng)性使用TNF-α治療會(huì)產(chǎn)生一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了其應(yīng)用。到目前為止，直接利用TNF-α殺滅腫瘤的治療方法進(jìn)展緩慢，僅局限于在隔離肢體灌注療法中治療黑色素瘤、骨肉

7、瘤等。利用抗體的靶向作用將藥物運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)部位已成為當(dāng)前靶向治療的主要手段和方法。已有研究表明，用單克隆抗體將TNF-α運(yùn)送到腫瘤組織血管部位，使其在該部位濃集，可以達(dá)到破壞腫瘤新生血管從而殺滅腫瘤的目的。CD20是B淋巴細(xì)胞上的跨膜蛋白質(zhì)分子，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。其在B細(xì)胞中特有的表達(dá)方式、生物學(xué)作用和存在形式?jīng)Q定了其成為治療B淋巴細(xì)胞瘤的主要靶點(diǎn)。研究表明，抗CD20的抗體可直接抑制B淋巴瘤細(xì)胞

8、生長并誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，該凋亡的發(fā)生與鈣離子相關(guān)，并且CD20分子的二聚化和多聚化能夠有效增強(qiáng)其誘導(dǎo)凋亡的能力。本實(shí)驗(yàn)在我室原有抗CD20Fab表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表達(dá)載體并表達(dá)出可溶性蛋白，之后又對其活性進(jìn)行了初步的研究探討。證明了CD20Fab部分具有與Raji細(xì)胞表面CD20分子的結(jié)合能力，并驗(yàn)證了融合蛋白TNF-α部分的細(xì)胞毒活性。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新性在于期望利用CD20抗體的靶向作用將TNF