SIRT1新型小分子抑制劑的虛擬篩選及抗肝癌活性的初步研究.pdf

1、背景：肝細胞癌（HCC）在惡性腫瘤中最常見且死亡率很高，全球惡性腫瘤死亡率位列第3，嚴重威脅人們的健康和生命。我國是HCC高發(fā)區(qū)，流行病學資料顯示其高居我國惡性腫瘤死亡率的第2位。目前肝切除和射頻消融是肝癌早期的常用治療手段，中晚期患者可采用肝動脈化療栓塞、放化療等手段，但是術(shù)后患者極易復發(fā)，放療、化療等也易使人產(chǎn)生耐藥性，預后較差。分子靶向抗腫瘤藥物在減少傳統(tǒng)化療藥物的全身性毒副作用和提高療效方面具有一定的優(yōu)越性，因此，HCC分子靶向

2、藥物的開發(fā)在控制HCC的腫瘤增殖、延緩腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及提高患者生活質(zhì)量等方面均具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)與酵母SIR2同源，是一類依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙?；浮IRT1定位于細胞核，胚胎早期含量豐富，并在成熟組織中表達廣泛，通過去乙?；揎椊M蛋白及多種非組蛋白來調(diào)節(jié)基因表達，參與細胞凋亡、分化、衰老、應激耐受及能量代謝等多種重要的生理活動。近年來，許多研究表明SIRT1與多種腫

3、瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是SIRT1與HCC的關(guān)系引起了研究人員的廣泛關(guān)注。臨床研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在HCC患者中異常高表達，并可預測其不良預后。進一步的研究表明，SIRT1在HCC細胞的增殖與腫瘤生長中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，且作用范圍廣泛，分子機制復雜。目前，以SIRT1這一新靶點抗肝細胞癌的治療藥物還未見有相關(guān)報道。因此，以STRTl為靶點的小分子抑制劑是創(chuàng)新抗肝細胞癌藥物開發(fā)的方向之一。
　　目的：基于SIRT1受體,選取EX

4、527、尼克酰胺與SIRT1蛋白的結(jié)合位點，通過高通量虛擬篩選和分子模擬等方法，篩選出對接打分較高的小分子抑制劑，在此基礎(chǔ)上，再進一步的篩選優(yōu)化、設(shè)計、合成，通過抑制肝癌細胞中 SIRT1的高表達，影響肝癌細胞的增殖，對其抗肝癌的活性進行體內(nèi)外效應實驗，為篩選及改造新型的以SIRT1為靶標的抗肝癌活性抑制劑奠定良好的理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴小分子數(shù)據(jù)庫 Drug Bank和 Chem下載小分子化合物庫，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB下載SIR

5、T1與配體復合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB：4I5I）；⑵運用分子對接等計算機虛擬篩選的方法，利用分子對接軟件 Discovery Studio3.0、SYBYL2.0，進行分子對接打分，選出其中與SIRT1活性口袋匹配度最高的小分子抑制劑；⑶分子動力學模擬測定小分子抑制劑與SIRT1受體的結(jié)合親和力，確定潛在活性小分子抑制劑；⑷CCK-8法檢測HepG2、MDA-231、KM3、K562、Caski、A549、Hela、Jurkat細胞經(jīng)小分子

6、抑制劑處理48h后的增殖抑制率，初步驗證小分子抑制劑是否能夠抑制腫瘤細胞生長，并篩選出其對何種腫瘤細胞的增殖抑制最為明顯；⑸以肝癌細胞HepG2為靶細胞，CCK-8法比較小分子抑制劑與EX527、尼克酰胺、Sirtinol等SIRT1抑制劑對HepG2細胞的增殖抑制率；⑹CCK-8法檢測SIRT1高表達的HepG2細胞、SIRT1低表達的Huh-7細胞及人肝細胞L02經(jīng)小分子抑制劑、陽性對照藥物EX527處理48h后的增殖抑制率，初步驗

7、證虛擬篩選獲得的小分子抑制劑是否具有SIRT1特異性；⑺對經(jīng)過陽性對照藥物EX527及小分子抑制劑處理48h后的HepG2細胞進行Annexin V-FITC/PI雙染，檢測對HepG2細胞的誘導凋亡作用；⑻Western blot法檢測經(jīng)不同濃度小分子抑制劑處理48h對HepG2細胞中SIRT1以及相關(guān)蛋白的表達情況的影響；⑼選取5-7w齡的裸鼠40只，腋下接種成瘤，建立人肝癌HepG2及Huh-7裸鼠模型各20只，隨機分為對照組和給

8、藥組，腹腔注射小分子抑制劑，每日觀察腫瘤的生長情況；⑽處死裸小鼠，摘取瘤體，計算抑瘤率，對瘤體石蠟切片，免疫組化法檢測SIRT1、P450蛋白表達情況。
　　結(jié)果：①以SIRT1（PDB ID:4I5I）為靶標，基于ADME/T性質(zhì)從Drug Bank和Chem數(shù)據(jù)庫篩選出83745個化合物，然后使用surflex Dock篩選和分子模擬驗證獲得 SIRT1抑制劑小分子抑制劑 T；分子動力學模擬計算小分子抑制劑T與SIRT1活性位

9、點結(jié)合后的結(jié)合自由能，證明小分子化合物T與SIRT1結(jié)合較為穩(wěn)定。②通過CCK-8增殖抑制試驗，結(jié)果表明：小分子抑制劑T能夠抑制腫瘤細胞生長，尤其對SIRT1高表達的HepG2細胞增殖抑制最為明顯，并且與其余三種SIRT1抑制劑相對照，小分子抑制劑T對HepG2的抑制作用呈明顯的濃度與時間依賴關(guān)系。③運用Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測結(jié)果表明：不同濃度的小分子抑制劑T及陽性對照藥物EX527對HepG2細胞均具有

10、誘導凋亡的作用，但小分子抑制劑T處理后的細胞凋亡率遠高于陽性對照物EX527。④Western blot法證實：HepG2細胞中SIRT1蛋白表達隨小分子抑制劑T的濃度變化而變化，并且小分子抑制劑T對相關(guān)蛋白的表達也有一定影響。⑤以高表達SIRT1的HepG2和低表達SIRT1的Huh-7肝癌細胞做為靶細胞，分別接種到裸鼠皮下，建立在體腫瘤模型，每日觀察腫瘤的生長情況，結(jié)果表明：小分子抑制劑T對HepG2裸鼠模型的腫瘤具有更顯著的抑制活

11、性，而對Huh-7裸鼠模型的腫瘤沒有抑制活性。⑥處死裸小鼠，摘取瘤體，計算抑瘤率，結(jié)果表明小分子抑制劑T對HepG2裸鼠模型的抑瘤率明顯高于Huh-7裸鼠模型。⑦選取瘤體做石蠟切片，免疫組化法檢測SIRT1、P450蛋白表達情況，結(jié)果表明：HepG2裸鼠模型給藥組的SIRT1蛋白表達較對照組低，而P450蛋白表達無明顯差異，Huh-7裸鼠模型給藥組與對照組SIRT1、P450蛋白表達均無明顯差異。
　　結(jié)論：基于SIRT1受體,選