小分子類肽氨肽酶N(APN-CD13)抑制劑的設(shè)計、合成及初步活性研究.pdf

1、目的:氨肽酶N(APN/CD13)，是一類鋅離子依賴性的膜結(jié)合Ⅱ型金屬蛋白酶，廣泛地分布于哺乳動物的小腸、腎臟、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與了營養(yǎng)素的最終水解以及生物活性分子如腦啡肽和內(nèi)啡肽的降解。此外，APN也是冠狀病毒入侵的受體，并參與了抗原遞呈的過程。更為重要的是，相比于正常細胞，APN在許多腫瘤細胞表面高水平表達，被稱作為腫瘤細胞標記物，在惡性腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤新血管生成等過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，APN已經(jīng)成為

2、抗腫瘤藥物研究的一個重要靶點。
　　 目前，研究報道的APN抑制劑主要有天然產(chǎn)物以及化學合成小分子兩大類。天然產(chǎn)物主要包括:Bestatin、Amastatin、Lapstatin、Probestin、Leuhistin、AHPA-Val、PsammaplinA、Betulinicacid等;化學合成小分子主要有:β-氨基硫醇類、α-氨基醛類、α-氨基磷酸類、AHPA類、L-異谷氨酸類、α-氨基硼酸類、環(huán)酰亞胺類、L-賴氨酸衍生

3、物類、氯霉胺衍生物類以及黃酮-8-乙酸衍生物類等。但到目前為止，只有Bestatin是唯一一個已經(jīng)上市的APN抑制劑，臨床上主要用于急性非淋巴性白血病的輔助治療。Bestatin作為天然產(chǎn)物，來源有限，除了對APN有抑制作用外，對體內(nèi)其他酶如:APB，LAP等也具有較強的抑制作用，這就需要通過藥物化學的方法來尋找和開發(fā)具有高選擇性和低毒性的APN抑制劑。
　　 方法:本研究以APN為靶標，通過對其活性位點結(jié)構(gòu)分析以及在實驗室前期

4、工作的基礎(chǔ)上，通過合理藥物設(shè)計，引入了類肽的藥物設(shè)計原則，設(shè)計、合成了環(huán)酰亞胺類、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸衍生物類、3-苯基異絲氨酸衍生物類和L-苯甘氨酸衍生物類四個系列共94個小分子類肽化合物，并對其進行了初步的體外抑制APN和MMP-2酶活、抗腫瘤細胞增殖、體外抑制血管生成以及小鼠體內(nèi)抑制黑色素瘤B16BL6細胞肺轉(zhuǎn)移實驗等，以期找到具有良好APN抑制活性的化合物。
　　 結(jié)果:本研究共設(shè)計、合成了四個系列94個

5、小分子類肽化合物，并對所合成的目標化合物通過電噴霧質(zhì)譜以及核磁共振氫譜等方法進行了結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)查閱文獻證實，所合成的目標化合物均為新型化合物，未見文獻報道。
　　 初步的體外抑酶活性實驗結(jié)果顯示，在A系列化合物中，大部分化合物都表現(xiàn)出較好的APN抑制活性，其中化合物7c活性最好，IC50值達到5.00μM，與陽性對照Bestatin(IC50=4.18μM)相當。在B系列化合物中，我們引入了具有構(gòu)象限制的Tic結(jié)構(gòu)片段，相比于A

6、系列化合物而言，本系列化合物活性并沒有明顯提高，只有化合物23h，結(jié)構(gòu)中含有的苯甘氨酸羥肟酸殘基，可能與APN活性位點能更好匹配，化合物活性最好，IC50值達到6.28μM，與陽性對照Bestatin(IC50=5.55μM)很接近;另外，化合物結(jié)構(gòu)中含有苯丙氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸羥肟酸殘基時，活性也較好，如:化合物23i、23j、23k等。在C系列化合物的設(shè)計過程中，我們引入了與AHPA具有類似結(jié)構(gòu)的3-苯基異絲氨酸片段，但體外抑酶活

7、性結(jié)果顯示本系列化合物對APN抑制活性普遍較差，只有結(jié)構(gòu)中含有羥肟酸基團的化合物，如:30a，30b和30e等活性較好，其中化合物30e活性最好，IC50值達到1.26μM，比陽性對照Bestatin(IC50=2.55μM)活性要好。由于B系列和C系列中活性最好的化合物23h和30e結(jié)構(gòu)中都含有苯甘氨酸羥肟酸殘基，我們推測苯甘氨酸片段可能與APN活性位點空腔能更好地匹配，于是，我們保留苯甘氨酸及羥肟酸部分，同時將苯甘氨酸的氨基與不同的

8、芳酸或取代芳酸連接，設(shè)計、合成了D系列化合物。體外抑酶活性結(jié)果顯示，本系列化合物活性普遍較好，IC50值在1.36-19.94μM之間，其中化合物38d活性最好，IC50值為1.36μM，要優(yōu)于陽性對照Bestatin(IC50=6.40μM)。
　　 在體外抗腫瘤細胞增殖實驗中，通過MTT法測定了部分體外抑酶活性較好的化合物對腫瘤細胞HL-60，ES-2，MDA-MB-231以及小鼠黑色素瘤B16BL6等細胞的生長抑制作用，結(jié)

9、果顯示體外對APN抑制作用較強的化合物，對APN表達量相對較高的腫瘤細胞，如:HL-60，ES-2和B16BL6細胞等同樣具有較高的增殖抑制活性;化合物30e和38d對ES-2和B16BL6腫瘤細胞的生長抑制活性優(yōu)于陽性對照Bestatin，其中化合物38d活性最好。
　　 體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞成管腔實驗和大鼠主動脈環(huán)微血管生成實驗結(jié)果顯示化合物30e和38d均具有顯著的體外抑制血管生成作用，其中化合物38d抑制大鼠主動脈環(huán)微血

10、管生成的活性最好，在200μmol/L濃度時大鼠動脈環(huán)周圍幾乎看不到微血管生成。
　　 在抑制小鼠黑色素瘤B16BL6肺轉(zhuǎn)移實驗中，在100mg/kg/d劑量下，化合物30e和38d均能顯著抑制小鼠黑色素瘤B16BL6細胞的肺轉(zhuǎn)移，抑制率分別為35.59％、46.89％(其中陽性對照Bestatin的抑制率為33.33％)。
　　 結(jié)論:本研究基于大腸桿菌APN的晶體結(jié)構(gòu)及其抑制劑Bestatin與活性位點的結(jié)合模式，在