皮膚來源前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其分化過程中基因表達(dá)變化的初步研究.pdf

1、目的：
　　 周圍神經(jīng)損傷是臨床上的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類的健康。根據(jù)損傷程度（Sunderland分型）及致傷原因可分為多種類型，其傳統(tǒng)的修復(fù)方法（神經(jīng)松解、縫合、移植及植入等）對神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷、缺損患者的治療效果不甚理想。
　　 尋找比較理想的治療方法一直是創(chuàng)傷外科、手外科等學(xué)科研究的熱點。近年來，組織工程學(xué)技術(shù)作為治療周圍神經(jīng)損傷的一種新方法成為許多學(xué)者研究的對象。
　　 雪旺細(xì)胞（Schwann ce

2、ll,SCs）來源于神經(jīng)嵴，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，大量研究證實其對周圍神經(jīng)及脊髓損傷的髓鞘再生及功能恢復(fù)有重要作用。人雪旺細(xì)胞來源于侵入性神經(jīng)活檢，并且其體外培養(yǎng)增殖受限，難以獲得大量子代細(xì)胞，因而其無法作為種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞解決了這一難題，但其卻不能產(chǎn)生真正有功能的雪旺細(xì)胞。同樣，胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞因倫理學(xué)、組織來源的限制及同種異體移植引發(fā)的嚴(yán)重排斥反應(yīng)而限制了其臨床應(yīng)用。因而，尋找一種合適的種子細(xì)胞

3、成為組織工程治療周圍神經(jīng)損傷的關(guān)鍵。
　　 2001年，Toma、Miller等從小鼠背部皮膚中獲得了一種具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，將其命名為皮膚來源前體細(xì)胞（Skin-derived Precursors,SKPs），其可分化產(chǎn)生神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、平滑肌、脂肪等多種細(xì)胞類型。現(xiàn)已證實，SKPs來源胚胎發(fā)育時期的神經(jīng)嵴，系神經(jīng)嵴來源的前體細(xì)胞，隨胚胎發(fā)育而遷移，最終主要位于成體皮膚毛囊的真皮乳頭。SKP細(xì)胞體外增殖、分化的培養(yǎng)

4、條件已基本成熟，在體外可大量增殖而保持其分化特性，在戰(zhàn)栗鼠（Shivere mice）周圍神經(jīng)損傷模型中，SKPs 及其來源的雪旺細(xì)胞均可促進(jìn)成髓鞘過程和神經(jīng)軸突連續(xù)性的恢復(fù)。由此可見，SKPs 可以產(chǎn)生真正有功能的雪旺細(xì)胞，加之其取材方便，對機(jī)體損傷小，且能夠進(jìn)行自體移植從而避免排斥反應(yīng)，因而SKPs 可成為治療周圍神經(jīng)損傷的一種新的、可接受的自體干細(xì)胞移植來源。
　　 目前對SKPs的研究雖已取得較多成果，但其增殖及分化的具

5、體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。目前胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)嵴形成、遷移及分化的具體機(jī)制已基本明了，其中Notch、Wnt、Sox-10等多種信號通路及分子參與了神經(jīng)嵴分化的調(diào)節(jié)。既然SKP細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴，且其生物及分化特性與神經(jīng)嵴細(xì)胞極為相似，那么其分化調(diào)控機(jī)制是否也與神經(jīng)嵴細(xì)胞相似呢？對SKP細(xì)胞分化調(diào)控的研究，將有利于我們增加其向雪旺細(xì)胞分化的數(shù)量，從而為組織工程提供合適的種子細(xì)胞，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生及功能恢復(fù)。我們受上述啟發(fā)，設(shè)計了本項實驗，初步

6、探討SKPs分化過程中基因表達(dá)的變化，為進(jìn)一步探討Notch、Wnt等信號通路在分化調(diào)控中的作用提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1.取新生（鼠齡為3d）SPF 級昆明小鼠的背部皮膚，消化、分離，懸浮法培養(yǎng)SKP細(xì)胞，常規(guī)方法進(jìn)行傳代，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞染色法檢測巢蛋白（nestin）的表達(dá)，RT-PCR檢測纖維連接蛋白（Fibronectin）相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 2.傳代細(xì)胞分組，分別向神經(jīng)

7、元及雪旺細(xì)胞方向分化，光鏡下觀察，免疫細(xì)胞染色法檢測神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞標(biāo)志物（NeuN、GFAP）的表達(dá)，RT-PCR法檢測神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞標(biāo)志物（NFM、CNPase）相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 3.用流式細(xì)胞儀分選SKPs,獲得側(cè)群細(xì)胞，然后分別誘導(dǎo)其向神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞分化，各組于不同的時間點收集細(xì)胞后提取總RNA，體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記后通過Microarray 檢測分析分化過程中各組細(xì)胞與原代SP細(xì)胞相比基因表達(dá)的差異，其中關(guān)鍵的結(jié)果通

8、過定量RT-PCR方法給予進(jìn)一步驗證。
　　 結(jié)果：
　　 1.懸浮法培養(yǎng)的小鼠SKPs 生長良好，增殖旺盛，形成明顯細(xì)胞球，且表達(dá)nestin及Fibronectin。
　　 2.SKPs分化培養(yǎng)過程中，neuron組及schwann組細(xì)胞形態(tài)有明顯差異，neuron組細(xì)胞表達(dá)NFM和NeuN，而schwann組表達(dá)GFAP 及CNPase。
　　 3.SP細(xì)胞分化培養(yǎng)1天后，與原代SP細(xì)胞相比基因表達(dá)