鈣激活氯通道TMEM16A在小鼠心肌組織的表達(dá).pdf

1、目的:鈣激活氯通道(Calcium-activatedCholirdeChannels,CaCC)是心肌主要的氯離子通道之一,該通道與正常心肌細(xì)胞的電活動(dòng)和某些心臟疾病(如心肌梗死,心力衰竭)關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)探討鈣激活氯通道蛋白TMEM16A在小鼠心肌組織的表達(dá)。
　　 材料和方法:1.清潔級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自青島市藥檢所。成年小鼠,體重25-35mg,新生小鼠出生1-3天內(nèi)使用。2.拉頸處死后迅速取出心臟,取50-100mg心肌組

2、織以Trizol試劑提取總RNA。以提取的DNA為模板,采用RT-PCR檢測(cè)心肌TMEM16AmRNA的表達(dá)。3.成年小鼠快速處死后取出lOOmg心肌組織,4g/L多聚甲醛(4℃)固定6-8h,轉(zhuǎn)入300g/L蔗糖放置24h至沉底,做14um厚連續(xù)冷凍切片。免疫熒光法檢測(cè)心肌TMEM16A蛋白的表達(dá)。4.成年小鼠取出心臟后,用RIPA裂解液裂解后提取蛋白,酶標(biāo)儀測(cè)出蛋白濃度,免疫印跡法檢測(cè)成年小鼠心肌組織的TMEM16A蛋白的表達(dá)。

3、r>　　 結(jié)果:1.新生及成年小鼠TMEM16A目的基因的擴(kuò)增條帶為330bp,與TMEM16AcDNA陽(yáng)性對(duì)照位于同一水平,提示二者心肌均有TMEM16AmRNA的表達(dá)。差異無(wú)顯著性(n=4,t:0.7698,P＞0.05)。2.成年小鼠心肌切片用兔抗鼠TMEM16A抗體(一抗)處理后再加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)染色,激光共聚焦顯微鏡下顯示綠色熒光信號(hào),WGA-TMR標(biāo)記的細(xì)胞膜呈紅色熒光,二者融合呈黃色。陰性對(duì)照(PB

4、S代替一抗)未見(jiàn)綠色熒光,僅見(jiàn)紅色的細(xì)胞膜。提示小鼠心肌組織存在TMEM16A蛋白的表達(dá),且主要定位于細(xì)胞膜上。3.成年小鼠TMEM16A目的基因的擴(kuò)增條帶是130kb,與TMEM16A陽(yáng)性對(duì)照位于同一水平,提示成年小鼠心肌組織中有TMEM16A的表達(dá)。
　　 結(jié)論:本研究利用分子生物學(xué)、免疫熒光染色技術(shù)和免疫印跡法,在小鼠心肌組織成功地檢測(cè)到TMEM16AmRNA和蛋白的表達(dá)。新生小鼠和成年小鼠TMEM16AmRNA水平無(wú)明顯