TMEM16A蛋白在脂多糖致A549損傷后炎癥反應(yīng)及凋亡中的作用的研究.pdf

1、急性肺損傷(acutelunginjureALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndromeARDS)是臨床上危重病人嚴(yán)重的并發(fā)癥和重要的死亡原因，其相關(guān)的死亡率仍高達(dá)40％，治療效果差，與其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。急性肺損傷的病理基礎(chǔ)包括有過度、持續(xù)的肺泡炎癥伴有肺泡上皮細(xì)胞受損甚至死亡。肺泡上皮細(xì)胞(AlveolarepithelialcellsAECs)是致病原攻擊的首要靶細(xì)胞，也是炎癥活化細(xì)

2、胞和效應(yīng)細(xì)胞，能被LPS激活，釋放IL-8，IL-6，TNF-α，ICAM-1等炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙和凋亡、壞死等改變，A549細(xì)胞廣泛應(yīng)用于肺泡上皮細(xì)胞的損傷-保護(hù)機(jī)制研究中。
　　 2008年三個(gè)獨(dú)立的研究小組分別采用不同的實(shí)驗(yàn)研究和理論預(yù)測(cè)的策略，驗(yàn)證TMEM16A可能為CaCC的分子基礎(chǔ)，CaCCs屬于陰離子通道，在不同的組織器官起著各種各樣的作用，在體和體外試驗(yàn)均證實(shí)TMEM16A是鈣離子依賴性氯

3、離子分泌所必須的。TMEM16A高表達(dá)能夠抑制囊性纖維化患者氣道上皮細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A表達(dá)于大鼠正常肺泡上皮細(xì)胞，大腸桿菌氣道注入復(fù)制的急性肺損傷大鼠模型肺組織內(nèi)TMEM16A蛋白較正常大鼠的表達(dá)水平減低，推測(cè)TMEM16A在急性肺損傷中起作用。人Ⅱ型上皮細(xì)胞是否表達(dá)TMEM16A，在LPS誘導(dǎo)的急性肺泡上皮損傷中TMEM16A表達(dá)有何變化，TMEM16A對(duì)急性肺損傷中肺泡上皮細(xì)胞分泌炎性因子、凋

4、亡的影響是我們?cè)谠囼?yàn)中擬解決的問題。本課題以肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549為研究對(duì)象，以分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)為手段，系統(tǒng)研究了以下幾方面內(nèi)容:(1)LPS刺激誘導(dǎo)急性上皮損傷模型的建立。觀察TMEM16A蛋白在A549中的表達(dá)及LPS刺激對(duì)TMEM16A表達(dá)的影響。(2)穩(wěn)定表達(dá)TMEM16A蛋白的A549細(xì)胞株的建立及其鑒定。(3)過表達(dá)TMEM16A對(duì)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌炎性因子及細(xì)胞凋亡的作用。(4)siRNA干擾TME

5、M16A對(duì)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌炎性因子的作用。論文具體內(nèi)容如下:
　　 第一部分:脂多糖刺激下TMEM16A在人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控
　　 目的:復(fù)制LPS誘導(dǎo)肺泡上皮急性損傷模型,觀察在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞急性損傷時(shí)TMEM16A的變化，驗(yàn)證TMEM16A是否表達(dá)于人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，是否參與了急性肺損傷過程。
　　 方法:以LPS刺激A549細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平，用An

6、nexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞經(jīng)FCM測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，以此驗(yàn)證LPS誘導(dǎo)肺泡上皮急性損傷模型復(fù)制成功。加入LPS前和加入刺激后6h、12h、24h、36h、48h分別收集細(xì)胞，提取蛋白，定量，用westernblots法測(cè)定指定時(shí)間點(diǎn)TMEM16A蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.LPS刺激可誘導(dǎo)急性肺泡上皮損傷。(1)LPS刺激前及刺激后3，6，12，24h共五個(gè)時(shí)相點(diǎn)TNF-

7、α水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與未受刺激的A549細(xì)胞相比，LPS刺激的A549細(xì)胞的TNF-αt水平于刺激后3，6，12，24h四個(gè)時(shí)相點(diǎn)顯著升高，并以6h上調(diào)水平最高。(2)透射電鏡觀察:LPS刺激的A549細(xì)胞表面的微絨毛減少，細(xì)胞內(nèi)可見大量的空泡，線粒體部分嵴和少部分膜融合，模糊不清，可見嵴缺失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，可見顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象。(3)LPS刺激24小時(shí)后早期凋亡和晚期凋亡、壞死明顯增加。
　　 2.A549細(xì)胞表達(dá)有

8、TMEM16A蛋白，LPS刺激后6小時(shí)，12小時(shí)TMEM16A的表達(dá)量與加刺激前組相比無差異，LPS刺激后24小時(shí)、36小時(shí)TMEM16A的表達(dá)量明顯增高，與加刺激前組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS刺激后48小時(shí)TMEM16A的表達(dá)量明顯減低，與加刺激前組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:脂多糖可誘導(dǎo)A549細(xì)胞活化，分泌TNF-α，誘導(dǎo)其早期、晚期凋亡，加劇細(xì)胞損傷，成功建立了脂多糖誘導(dǎo)的急性肺泡上皮損傷模型，并發(fā)現(xiàn)T

9、MEM16A在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中有表達(dá)，并且在脂多糖誘導(dǎo)下TMEM16A蛋白表達(dá)水平有動(dòng)態(tài)改變，提示TMEM16A參與了急性肺泡上皮損傷過程。
　　 第二部分:TMEM16A高表達(dá)抑制脂多糖誘導(dǎo)A549分泌炎性因子及凋亡
　　 目的:建立TMEM16A穩(wěn)定高表達(dá)的A549細(xì)胞株，研究TMEM16A過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)A549急性損傷時(shí)炎性因子的分泌及細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法:將TMEM16A-pCMV6-Kan

10、/Neo重組質(zhì)粒擴(kuò)增后，堿裂解法抽提，獲得較多量的質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體2000，將TMEM16A基因轉(zhuǎn)至A549細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，單克隆化，并經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR，免疫印跡驗(yàn)證建立TMEM16A穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株。采用ELASA方法測(cè)定不同處理組分泌的炎癥因子TNF-α、IL-8水平。采用AnnexinV-FITC/P1雙染法應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)不同處理組間的細(xì)胞凋亡率的情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.pCMV-TMEM1

11、6A經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，再經(jīng)G418篩選，單克隆化，實(shí)時(shí)定量PCR顯示:未處理的A549組、pCMV6空載體陰性對(duì)照組和pCMV6-TMEM16轉(zhuǎn)染組三組間相對(duì)mRNA水平有顯著性差異，其中pCMV6-TMEM16A轉(zhuǎn)染組明顯高于未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對(duì)照組。而未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對(duì)照組兩組間無顯著性差異。Westemblot分析發(fā)現(xiàn)，pCMV-TMEM16AA549細(xì)胞在114KD

12、左右能檢測(cè)到明顯的蛋白條帶，而A549及pCMV6空載體陰性對(duì)照組僅見少量?jī)?nèi)源性TMEM16A蛋白表達(dá)，定量分析顯示:三組間TMEM16A蛋白表達(dá)水平有顯著性差異，其中pCMV6-TMEM16A轉(zhuǎn)染組明顯高于未處理的A549組及pCMV6空載體陰性對(duì)照組，而A549組及pCMV6空載體陰性對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示外源性TMEM16A基因已整合入A549細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)蛋白，成功建立了TMEM16A穩(wěn)定高表達(dá)的A549細(xì)胞株。
　　

13、 2.無LPS刺激時(shí)，上述三組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)相TNF-α，IL-8水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在LPS刺激下三組TNF-α，IL-8水平在多個(gè)時(shí)相均顯著增高，但TMEM16A的高表達(dá)組與其它兩組相比，在相同時(shí)相TNF-α，IL-8水平顯著降低。即TMEM16A高表達(dá)能明顯下調(diào)但不能完全阻斷LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞分泌TNF-α、IL-8的作用。
　　 3.在無LPS刺激時(shí)，A549細(xì)胞、pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞與TMEM16A穩(wěn)定

14、高表達(dá)的A549細(xì)胞相比三組間細(xì)胞早期、晚期/壞死凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明在無LPS刺激時(shí)TMEM16A高表達(dá)不影響細(xì)胞的凋亡。三組細(xì)胞在LPS刺激24小時(shí)后與刺激前相比，細(xì)胞的早期、晚期凋亡/壞死率均顯著增高，即LPS作用于上述三組細(xì)胞24小時(shí)均可使其早期、晚期/壞死凋亡率凋亡率明顯增加。在LPS刺激24小時(shí)后，三組間的早期凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中A549細(xì)胞與pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的早期凋亡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而TMEM16A高表

15、達(dá)的A549細(xì)胞組比A549細(xì)胞組、pCMV空載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的細(xì)胞早期凋亡率降低。在LPS刺激24小時(shí)后，三組間的晚期凋亡及壞死率間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明pCMV空載體轉(zhuǎn)染不影響LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的改變，TMEM16A的高表達(dá)卻可明顯的減低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡。文中以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:成功建立了TMEM16A穩(wěn)定高表達(dá)的A549細(xì)胞株，TMEM16A高表達(dá)可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)肺泡上皮

16、細(xì)胞活化分泌炎性因子及細(xì)胞早期凋亡。
　　 第三部分慢病毒介導(dǎo)RNAi敲除TMEM16A對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的A549分泌炎性因子的作用
　　 目的:慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)人肺泡Ⅱ型上皮株A549細(xì)胞TMEM16A表達(dá)，研究TMEM16A基因敲除對(duì)LPS誘導(dǎo)A549急性損傷時(shí)炎性因子的分泌的影響。
　　 方法:委托上海吉?jiǎng)P基因公司，設(shè)計(jì)并制備出4條針對(duì)TMEM16A基因的RNAi序列及1條陰性對(duì)照序列

17、，分別與GV115-GFP載體連接，構(gòu)建5個(gè)重組慢病毒表達(dá)載體TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#,TMEM16A-RNAi-LV3#，TMEM16A-RNAi-LV4#和Screamble-RNAi;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選陽性克隆、測(cè)序鑒定。將重組慢病毒載體、pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測(cè)定病毒滴度。將包裝產(chǎn)生的5種重組慢

18、病毒分別感染A549細(xì)胞，熒光顯微鏡下了解感染效率，并經(jīng)westernblots檢測(cè)顯示TMEM16A-RNAi-LV3#消減TMEM16A的效率最高，故選用TMEM16A-RNAi-LV3#進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，下文中TMEM16A-RNAi-LV即指TMEM16A-RNAi-LV3#，實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡檢測(cè)TMEM16A-RNAi-LV感染的A549細(xì)胞TMEM16AmRNA和蛋白的表達(dá)，并與未感染的A549細(xì)胞及Scr-RNAi-L

19、V感染細(xì)胞進(jìn)行比較。采用ELISA法測(cè)定非感染A549細(xì)胞組(A549)，Scr-RNAi-LV感染組（RNA干擾陰性對(duì)照組RNC），TMEM16A-RNAi-LV感染組(TMEM16A基因敲減組KD)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-8水平并做比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.熒光顯微鏡顯示重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞72小時(shí)后，TMEM16A-RNAi-LV1#,TMEM16A-RNAi-LV2#,TMEM1

20、6A-RNAi-LV3#感染組均表達(dá)綠色熒光蛋白，表示成功轉(zhuǎn)入了A549細(xì)胞，而TMEM16A-RNAi-LV4#感染組未見熒光，提示未能成功轉(zhuǎn)入了A549細(xì)胞。
　　 2.對(duì)TMEM16A-RNAi-LV1#，TMEM16A-RNAi-LV2#,TMEM16A-RNAi-LV3#感染的A549行westernblot檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TMEM16A-RNAi-LV3#對(duì)TMEM16A蛋白表達(dá)的抑制明顯，所以選用TMEM16A-RNAi

21、-LV3#進(jìn)行下步試驗(yàn)。
　　 3.將TMEM16A-RNAi-LV、Scr-RNAi-LV感染A549細(xì)胞，并與未感染的A549細(xì)胞相比較發(fā)現(xiàn)TMEM16A-RNAi-LV感染組TMEM16A基因mRNA和蛋白的表達(dá)量與未感染慢病毒的細(xì)胞組及空載體感染組相比均明顯下降(P＜0.05)。
　　 4.無LPS刺激時(shí)，上述三組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)相TNF-α，IL-8水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明TMEM16A基因消減不影響Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌

22、TNF-α，IL-8。在LPS刺激下三組TNF-α，IL-8水平在多個(gè)時(shí)相均顯著增高，并且TMEM16A消減組與其它兩組相比，在相同時(shí)相TNF-α，IL-8水平顯著增高，說明TMEM16A的消減明顯加強(qiáng)了TNF-α、IL-8分泌，即TMEM16A的消減能明顯促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞TNF-α、IL-8分泌的作用。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建并經(jīng)篩靶找出了針對(duì)TMEM16A基因的慢病毒載體TMEM16A-RNAi-LV,體外感染A5