急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TMEM16A的表達(dá)研究.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是機(jī)體遭受各種打擊時(shí)引起的以肺泡毛細(xì)血管通透性增加為特征的肺部炎癥綜合征，發(fā)病急、病情重，未經(jīng)有效治療可以發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)。臨床表現(xiàn)為難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺動(dòng)脈高壓而體循環(huán)低血壓。盡管目前對(duì)其治療措施已有很大進(jìn)展，其死亡率仍在50％左右。急性肺水腫(acute pulmona

2、ry edema，APE)是ALI/ARDS的主要病理生理特點(diǎn)。臨床研究表明：早期清除ARDS患者肺泡內(nèi)的液體是其治療的關(guān)鍵。肺泡液體清除率(alveolar nuid clearanceAFC)與肺水腫關(guān)系密切，肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能正常對(duì)于肺水的清除十分重要，增加肺泡液體清除率可以促進(jìn)肺水腫的吸收。肺泡液體清除是肺泡上皮的主要功能之一。
　　肺泡上皮細(xì)胞由扁平的肺泡Ⅰ型細(xì)胞(ATⅠ)和立方形的肺泡Ⅱ型細(xì)胞(ATⅡ)組成，其主要功

3、能在于清除肺泡內(nèi)多余液體，保持肺泡相對(duì)干燥，維持氣體的正常交換。肺泡上皮細(xì)胞上存在的多種離子通道參與了肺水的液體轉(zhuǎn)運(yùn)。在眾多的離子通道中鈉離子通道對(duì)于肺泡液體清除的作用已經(jīng)被證實(shí)。水通道也己被證實(shí)存在于ATⅡ，且水通道蛋白1(AQP1)在ARDS狀態(tài)下表達(dá)顯著下降，朱麗華等在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)水通道蛋白4(AQP4)在ARDS狀態(tài)下表達(dá)增加。盡管氯離子通道在體內(nèi)含量豐富，但是關(guān)于其與肺泡液體清除的研究卻很少。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)體(Cysti

4、c Fibrosis Trans-membrane conductance Regulator CFTR)氯離子通道是一種cAMP依賴(lài)性蛋白激酶和ATP調(diào)節(jié)的氯離子通道，已被證實(shí)存在于肺泡上皮細(xì)胞。谷秀等研究發(fā)現(xiàn)β-受體激動(dòng)劑和CFTR通道激動(dòng)劑均可提高離體大鼠的AFC，且前者提高AFC的作用部分是通過(guò)CFTR完成的。多項(xiàng)研究表明CFTR在肺泡液體的清除過(guò)程中發(fā)揮作用。但最近發(fā)表的報(bào)道未顯示β2-受體激動(dòng)劑改善ARDS預(yù)后的效應(yīng)，說(shuō)明影

5、響因素復(fù)雜。
　　TMEM16A是在2008被發(fā)現(xiàn)的鈣激活的氯離子通道，其在ALI中的作用尚未被人們所了解，本實(shí)驗(yàn)中選取TMEM16A為研究對(duì)象。通過(guò)靜脈注射LPS建立ALI模型，分離并純化ATⅡ，并在細(xì)胞水平檢測(cè)TMEM16A的表達(dá)變化。
　　方法：選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠24只，體重在180-220g，將其隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組，LPS模型組。每組6只大鼠用于肺組織病理學(xué)檢查，6只用于檢測(cè)TMEM16A的表達(dá)。LPS

6、組經(jīng)尾靜脈注射LPS(8 mg/kg)，對(duì)照組注射生理鹽水，2小時(shí)后取材。麻醉后經(jīng)股動(dòng)脈放血取新鮮肺組織。取左肺葉用10％福爾馬林溶液固定留作病理觀察。按照經(jīng)典的方法并加以改進(jìn)提取ATⅡ。將大鼠麻醉后行氣管切開(kāi)，經(jīng)肺動(dòng)脈插管，行肺動(dòng)脈灌洗的同時(shí)行肺通氣。之后將肺組織移出胸腔，用胰蛋白酶和膠原酶對(duì)肺組織進(jìn)行消化。之后剪碎肺組織，過(guò)濾細(xì)胞懸液。對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行離心并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，進(jìn)行體外培養(yǎng)。應(yīng)用IgG免疫粘附法純化ATⅡ，應(yīng)用電鏡觀察和AK

7、P染色法對(duì)ATⅡ進(jìn)行鑒定。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平，免疫印跡法檢測(cè)TMEM16A的表達(dá)。
　　結(jié)果：1病理結(jié)果：正常組HE染色可見(jiàn)肺結(jié)構(gòu)完整，各處肺泡間隔厚度正常均一。血管腔內(nèi)未見(jiàn)紅細(xì)胞滲出，無(wú)灶性肺不張，僅有少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)。LPS模型組HE染色可見(jiàn)肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)增寬，肺間質(zhì)滲液明顯，毛細(xì)血管內(nèi)淤血。光鏡下肺組織病理評(píng)分LPS組(9.42±0.72)明顯高于正常對(duì)照組(0.70±0

8、.52)(P<0.01)。
　　2 ATⅡ的分離、純化和鑒定：通過(guò)電鏡和AKP染色鑒定大鼠ATⅡ。電鏡下觀察正常大鼠ATⅡ，可見(jiàn)其形狀規(guī)則，呈立方形或圓形，表面可見(jiàn)長(zhǎng)短不一的微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)板層小體等特征性結(jié)構(gòu)。LPS組純化后可獲得(1.35±0.04)×107個(gè)細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后LPS組細(xì)胞活力達(dá)(83±2.32)％。
　　3 ELISA結(jié)果：LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β的水平(33.33±2.48)明顯高于正常組(

9、14.68±0.95)(P<0.01)
　　4 Western blotting結(jié)果：TMEM16A蛋白表達(dá)水平正常組(1.01±0.10)與LPS組(1.00±0.07)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：1通過(guò)靜脈注射LPS可以造成大鼠的急性肺損傷，本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了ALI模型。
　　2適當(dāng)?shù)南笣舛取r(shí)間對(duì)于ATⅡ的分離至關(guān)重要。用IgG免疫粘附法可以提高ATⅡ的純度。電鏡下可以觀察到ATⅡ的典型結(jié)構(gòu)板