鈣激活氯通道TMEM16A功能特征以及與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系研究.pdf

1、鈣激活氯通道(CaCC)是一類陰離子通道，具有鈣離子和電壓依賴性。其組織分布廣泛，參與了眾多生理過程，如感覺傳導(dǎo)、神經(jīng)和心肌興奮性調(diào)節(jié)、平滑肌收縮、腺體和上皮分泌以及抑制多精受精等，甚至可能參與細(xì)胞分裂周期與細(xì)胞增殖。鈣激活氯通道生理病理意義如此重要，但直到2008年才有報(bào)道指出跨膜蛋白16A(TMEM16A)可能為組成鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)之一。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)在特定細(xì)胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關(guān)問題及其作用機(jī)制提供了新的研究平臺(tái)

2、。
　　在鑒定TMEM16A為CaCCs的分子基礎(chǔ)后，很多實(shí)驗(yàn)小組著眼于研究TMEM16A的功能調(diào)節(jié)劑，并取得了一定的進(jìn)展。但是目前還沒有報(bào)道針對(duì)TMEM16A的特異性調(diào)節(jié)劑，篩選TMEM16A功能特異性的調(diào)節(jié)劑仍須努力。TMEM16A的功能調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)將為研發(fā)治療高血壓、疼痛、腹瀉等疾病的藥物提供支持。
　　癌癥一直是困擾人類生命健康的一大難題，離子通道與腫瘤的關(guān)系早就引起了人們的關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A在非興奮

3、性組織起源的腫瘤中高表達(dá)，而在相同起源的正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。TMEM16A在許多腫瘤組織中高表達(dá)，現(xiàn)已成為胃腸間質(zhì)細(xì)胞瘤(GISTs)的標(biāo)志基因。但是TMEM16A在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其作用機(jī)制尚不清楚。
　　第一部分鈣激活氯通道TMEM16A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立及其通道電生理特性研究
　　目的：建立TMEM16A.的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，研究表達(dá)的TMEM6A電生理學(xué)特性及藥理學(xué)調(diào)節(jié)特征。
　　方法：(1)目的基因經(jīng)

4、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293A細(xì)胞。用加入G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周，挑選出單克隆細(xì)胞團(tuán)。(2)利用Real-timePCR、Western blot以及patch clamp實(shí)驗(yàn)方法鑒定出陽(yáng)性細(xì)胞株。(3)利用patch clamp觀察TMEM16A的電生理學(xué)特性。(4)觀察幾種氯通道調(diào)節(jié)劑對(duì)TMEM16A電流的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)Real-time PCR和Western blot實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染目的基因TMEM16A的細(xì)胞株其mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高。
　　(2)Patch clamp實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染TMEM16A基因的細(xì)胞株有明顯的鈣依賴的外向整流的電流。全細(xì)胞記錄模式下，細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子濃度為600 nM時(shí)，+100 mV時(shí)的電流可達(dá)1nA以上。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明了TMEM16A的穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293A細(xì)胞系已成功建立。
　　(3)利用建好的TMEM16A穩(wěn)轉(zhuǎn)

6、細(xì)胞系，采用patch clamp全細(xì)胞打孔模式記錄TMEM16A電流，TMEM16A電流可被ATP(100μM)和ionomycin(2μM)激活。細(xì)胞外液Cl-替換為葡萄糖酸根時(shí)，TMEM16A電流基本消失，而當(dāng)Cl-替換為F-、Br-、I-時(shí)，TMEM16A通道呈現(xiàn)對(duì)這些離子的不同通透性，通透程度順序與報(bào)道的CaCC通道類似。
　　(4)在TMEM16A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株上，TMEM16A開放劑Eact可在無內(nèi)Ca2+存在的情況下引

7、發(fā)TMEM16A電流，其EC50=1.18μM。CaCC、TMEM16A抑制劑tannic acid和CaCCinh-A01分別抑制由Eact激活的TMEM16A電流，其IC50分別為13.87μM和7.11μM。
　　結(jié)論：成功建立了TMEM16A的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。表達(dá)的TMEM16A電流特征與內(nèi)源性鈣激活氯通道(CaCC)相似。本細(xì)胞系為進(jìn)一步研究TMEM16A功能調(diào)節(jié)和篩選功能特異性調(diào)節(jié)劑奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分肺腺癌A

8、549細(xì)胞株TMEM16A電流特征及與細(xì)胞增殖的關(guān)系研究
　　目的：觀察A549細(xì)胞上是否存在TMEM16A通道表達(dá)，研究沉默TMEM16A通道后對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：(1)利用Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察在A549細(xì)胞上，是否有TMEM16A mRNA和蛋白表達(dá)。采用全細(xì)胞記錄模式記錄A549細(xì)胞上的TMEM16A電流。(2)用Gramicidin作打孔劑利用打孔膜片鉗方

9、法記錄A549細(xì)胞上的電流。(3)替換細(xì)胞外液Cl-離子，觀察不同陰離子對(duì)A549細(xì)胞上鈣激活氯電流的影響。(4)利用MTT實(shí)驗(yàn)觀察TMEM16A通道對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)在A549細(xì)胞上存在有TMEM16A mRNA和蛋白的表達(dá)。全細(xì)胞記錄模式下，記錄到A549細(xì)胞有一明顯鈣依賴的外向整流電流。
　　(2)利用Gramicidin做打

10、孔劑，ATP(100μM)和ionomycin(2μM)均可激活電流。采用全細(xì)胞打孔記錄模式，細(xì)胞外液CI替換為葡萄糖酸根時(shí)，電流基本消失，而當(dāng)其替換為F'、Br'、I'時(shí)，電流也呈現(xiàn)不同變化，與TMEM16A電流特征吻合。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A549存在功能性CaCC/TMEM16A。
　　(3)利用RNAi干擾抑制TMEM16A后，觀察到A549細(xì)胞的增殖速度明顯變慢。表明TMEM16A對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖過程有影響。
　　結(jié)論