苦參堿促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：當(dāng)前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一大殺手，對(duì)惡性腫瘤的防治成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要課題。越來(lái)越多的研究表明腫瘤發(fā)生不僅是由于瘤細(xì)胞的過(guò)度增生，還因?yàn)榱黾?xì)胞死亡過(guò)少，凋亡機(jī)制障礙。細(xì)胞凋亡參與腫瘤起始過(guò)程，并對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用。本研究運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討苦參堿(matrine)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A21-2和人骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并對(duì)促凋亡因子caspase-3進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)和分析，

2、以期進(jìn)一步闡明苦參堿抗癌的作用機(jī)制，為苦參堿的抗癌治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：將A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞置于37℃，飽和濕度5％的CO2培養(yǎng)箱常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。 1.應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：將不同濃度的苦參堿作用于A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并照相。 2.透射電子顯微鏡觀察：0.6mg/ml的苦參堿作用A21-2細(xì)胞和MG63

3、細(xì)胞72h后收集細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)為2.5％戊二醛4℃固定，用10g/L鋨酸后固定，丙酮系列脫水，最后用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，電鏡下觀察并照相。 3.采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。 4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布：收集經(jīng)苦參堿作用72h的A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，冷PBS漂洗，預(yù)冷70％乙醇，4℃固定，上機(jī)檢測(cè)前

4、離心去固定液，0.5％胃蛋白酶消化，碘化丙錠(PropidiumIodide，PI:50mg/L Trinton X-100 1.0％)室溫避光染色。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。 5 FCM檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)：收集經(jīng)苦參堿作用72h的A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的表達(dá)情況。 6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR

5、)檢測(cè)Caspase-3mRNA的表達(dá)：利用TRIZOL試劑盒提取經(jīng)苦參堿作用72h后的A21-2細(xì)胞、MG63細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰氨凝膠電泳，溴化乙錠(EB)顯色，Bio-profif凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像分析。 結(jié)果：(1)經(jīng)0.2、0.4、0.6mg/ml苦參堿處理A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞72h后，倒置相差顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，用藥組的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯被抑制，胞漿內(nèi)顆

6、粒增多增粗，部分細(xì)胞變圓而懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。透射電鏡下觀察到染色體凝集邊聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡。(2)分別用苦參堿(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml)作用于A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞48、72h，MTT結(jié)果顯示苦參堿能明顯抑制A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞的增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴性。作用48h和72h后，A21-2細(xì)胞半數(shù)抑制率(inhibitoryconcentration giving 50％ inhi

7、bition，It50)分別為1.017mg/ml、0.751 mg/ml，MG63細(xì)胞半數(shù)抑制率(inhibitoryconcentration giving 50％ inhibition，IC50)分別為1.019mg/ml與0.701mg/ml。1.0mg/ml苦參堿作用A21-2細(xì)胞和MG63細(xì)胞72h后抑制率可分別達(dá)到71.89％、71.16％(p<0.01)。(3)FCM分析發(fā)現(xiàn)，0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦參堿處

8、理細(xì)胞72h后，G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰。A21-2細(xì)胞凋亡率分別為13.54％±0.39％、17.93％±0.19％、26.35％±0.11％，細(xì)胞G0/G1期比例由對(duì)照組54.12％±1.23％升至59.35％±1.31％，67.52％±0.42％，77.53％±0.19％，S期、G2/M期細(xì)胞比例減少，MG63細(xì)胞凋亡率分別為11.37％±0.53％、14.28％±0.16％、24.13％±0.23％(p<0.01)，處理后的細(xì)

9、胞G0/G1期比例增高(由對(duì)照組63.21％±1.52％升至69.14％±1.12％，75.31％±0.33％，82.64％±0.16％)。caspase-3蛋白表達(dá)升高，A21-2細(xì)胞的熒光指數(shù)分別為1.60±0.03、1.78±0.02、2.08±0.05，MG63細(xì)胞的熒光指數(shù)分別為1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02。(4)RT-PCR結(jié)果表明：經(jīng)0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦參堿處理A21-2細(xì)胞