Cbfa1對小鼠牙囊細(xì)胞向成骨-成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景和目的：牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。組織的修復(fù)再生過程在很大程度上是生長發(fā)育過程的重演，因此明確組織形成的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)機(jī)制，對探索牙周組織再生非常重要。一般認(rèn)為，牙周組織發(fā)生的前體細(xì)胞由牙囊細(xì)胞分化而來。研究表明，牙囊細(xì)胞中含有成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在牙齒發(fā)育后期能形成牙骨質(zhì)、牙周膜及牙槽骨。因此，深入研究發(fā)育過程中調(diào)控牙囊細(xì)胞分

2、化的特異性因子及機(jī)制可為研究牙周組織再生所需要的細(xì)胞和分子提供重要的信息。 牙囊發(fā)育為成熟的牙周組織是一個非常復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞的分化，需要許多因子調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子α1(Cbfa1)，作為成骨細(xì)胞分化和骨發(fā)育的控制基因(mastergene)備受關(guān)注。Cbfa1對牙齒的發(fā)育同樣有重要作用。Cbfa1缺失鼠磨牙在帽狀早期停止發(fā)育，Cbfa1突變導(dǎo)致的顱鎖骨發(fā)育不良綜合征，除表現(xiàn)為骨形成異常外，也有很多牙齒疾患，

3、如多生牙，恒牙萌出延遲，細(xì)胞性牙骨質(zhì)缺失和牙根外形異常等。另外，Cbfa1在牙囊和牙乳頭中都有表達(dá)，而且隨著牙齒的進(jìn)一步發(fā)育和牙根、牙周組織的形成，Cbfa1的表達(dá)更為明顯，在成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周韌帶成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞中都有表達(dá)。這表明Cbfa1參與牙周細(xì)胞的分化和牙周組織的形成。 研究發(fā)現(xiàn)，非成骨細(xì)胞中Cbfa1超表達(dá)能誘導(dǎo)成骨特異性基因表達(dá)，如Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(O

4、C)、堿性磷酸酶(ALP)等；成骨細(xì)胞中，用反義核酸干擾Cbfa1表達(dá)抑制了成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成；而且，多種成骨細(xì)胞相關(guān)基因的啟動子都具有Cbfa1結(jié)合位點(diǎn)。這些基因都是成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的重要組分，表明Cbfa1可能通過調(diào)控這些成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)對成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞有重要作用。然而，Cbfa1對牙周組織的發(fā)育，對分化形成牙周組織的牙囊細(xì)胞的調(diào)控作用尚不明確。 骨形成蛋白-2(bonemo

5、rphogenicprotein-2，BMP-2)是轉(zhuǎn)錄生長因子-β超家族的成員之一，是研究最多的牙周組織再生的促進(jìn)因子之一。研究表明，BMP-2能有效促進(jìn)骨和牙骨質(zhì)形成。然而，BMP-2半衰期短，靶向性差，能擴(kuò)散作用于周圍的非骨組織，而且靶細(xì)胞表面需要特異性受體和輔助因子，這些都限制了BMP-2功能的發(fā)揮。目前，牙周組織再生中，BMP-2的應(yīng)用需要進(jìn)一步的深入研究。 因此，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，將Cbfa1導(dǎo)入牙囊細(xì)胞，使

6、其在牙囊細(xì)胞中穩(wěn)定超表達(dá)，觀察Cbfa1對牙囊細(xì)胞分化的調(diào)控作用。同時比較Cbfa1和BMP-2轉(zhuǎn)染牙囊細(xì)胞的生物學(xué)活性，以期為牙周組織發(fā)育和牙周組織再生提供一定的細(xì)胞分子生物學(xué)信息。 材料和方法 1.Cbfa1在小鼠牙囊細(xì)胞中的表達(dá) 取出生后5～7天BALB/c小鼠，分離解剖含下頜第一磨牙牙胚的下頜骨，制備組織切片，采用免疫組化和原位雜交方法，觀察Cbfa1蛋白和mRNA在牙囊細(xì)胞中的組織學(xué)定位；隨后體視顯微鏡

7、下取出生后5～7天BALB/c小鼠下頜第一磨牙的牙囊組織，原代培養(yǎng)牙囊細(xì)胞，分別提取牙囊細(xì)胞的總RNA和蛋白，采用RT-PCR和Westernblot法觀察Cbfa1mRNA和蛋白在體外培養(yǎng)牙囊細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2.超表達(dá)Cbfa1對牙囊細(xì)胞向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化的影響 構(gòu)建Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-IRES-Cbfa1，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67，G418篩選獲得穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞株；

8、然后用含Cbfa1病毒的培養(yǎng)液感染牙囊細(xì)胞，抗生素篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)Cbfa1的牙囊細(xì)胞；采用實(shí)時RT-PCR檢測超表達(dá)Cbfa1對牙囊細(xì)胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的作用，包括ALP、OC、OPN、BSP、ColI、牙骨質(zhì)附著蛋白(cementumattachmentprotein，CAP)和牙骨質(zhì)蛋白(cementum-derivedprotein23，CP23)等，同時采用體外礦化結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)檢測超表達(dá)Cbfa1對牙囊細(xì)胞體外礦化能

9、力的影響，實(shí)驗(yàn)以正常牙囊細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細(xì)胞作對照。 通過刪除Cbfa1轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)VWRPY元件構(gòu)建增強(qiáng)型Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-IRES-Cbfa1(E)，并獲得穩(wěn)定超表達(dá)增強(qiáng)型Cbfa1的牙囊細(xì)胞，觀察增強(qiáng)型Cbfa1對牙囊細(xì)胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的作用和對牙囊細(xì)胞體外礦化能力的影響。 3.牙囊細(xì)胞中Cbfa1、BMP-2超表達(dá)對成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)影響的比較 構(gòu)建

10、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒，并用Cbfa1、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染牙囊細(xì)胞，獲得穩(wěn)定超表達(dá)Cbfa1、BMP-2的牙囊細(xì)胞。采用實(shí)時RT-PCR和體外礦化結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)檢測并比較超表達(dá)Cbfa1和BMP-2對牙囊細(xì)胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的作用和對牙囊細(xì)胞體外礦化能力的影響。實(shí)驗(yàn)以正常牙囊細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細(xì)胞作對照。 結(jié)果 1.Cbfa1在小鼠牙囊細(xì)胞中的表達(dá) 出生后5-7天BALB/c小鼠下頜第

11、一磨牙牙胚處于鐘狀晚期，上皮根鞘清晰可見，牙根還沒有開始發(fā)育，牙囊組織疏松的環(huán)繞在成釉器周圍。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Cbfa1mRNA在牙囊細(xì)胞的胞漿中有表達(dá)，但Cbfa1蛋白在牙囊組織中未見表達(dá)。對體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Cbfa1mRNA在培養(yǎng)牙囊細(xì)胞中陽性表達(dá)，Westernblot檢測未見Cbfa1蛋白表達(dá)，與體內(nèi)牙囊細(xì)胞的檢測結(jié)果相一致。 2.超表達(dá)Cbfa1促進(jìn)牙囊細(xì)胞向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化的影響

12、 構(gòu)建的Cbfa1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-IRES-Cbfa1經(jīng)酶切電泳分析和序列測定，插入的Cbfa1片段與GeneBank中Cbfa1序列完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功。將包裝細(xì)胞PT67包裝形成的Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牙囊細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)Cbfa1的牙囊細(xì)胞。感染細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光，實(shí)時RT-PCR發(fā)現(xiàn)Cbfa1病毒感染細(xì)胞中Cbfa1mRNA表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)，是正常和空載體感

13、染細(xì)胞的5～10倍，并能檢測到Cbfa1蛋白表達(dá)，穩(wěn)定超表達(dá)Cbfa1的牙囊細(xì)胞構(gòu)建成功。 牙囊細(xì)胞中可檢測到成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因(ColI、ALP、OPN、BSP、OC、CAP和CP23)的表達(dá)。Cbfa1超表達(dá)牙囊細(xì)胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因(OC、BSP、OPN、ColI、CAP和CP23)的表達(dá)顯著高于正常牙囊細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細(xì)胞(P＜0.01)；而ALP的表達(dá)受到抑制(P＜0.01)。Cbfa1(E)

14、對部分成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因(OC、OPN、ColI和CP23)表達(dá)的促進(jìn)作用強(qiáng)于Cbfa1(P＜0.01)，而Cbfa1對CAP的促進(jìn)作用強(qiáng)于Cbfa1(E)(P＜0.01)，二者對BSP和ALP的作用無明顯差異(P＞0.05)。 礦化結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)觀察到，牙囊細(xì)胞和病毒感染牙囊細(xì)胞中均有黑褐色的礦化結(jié)節(jié)形成，且隨著培養(yǎng)時間增長，形成的礦化結(jié)節(jié)逐漸增多。Cbfa1感染牙囊細(xì)胞中，礦化結(jié)節(jié)的量明顯多于正常牙囊細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空

15、載體的牙囊細(xì)胞(P＜0.01)，而Cbfa1(E)對礦化結(jié)節(jié)形成的增強(qiáng)能力大于Cbfa1(P＜0.05)。 3.牙囊細(xì)胞中Cbfa1、BMP-2超表達(dá)對成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)影響的比較 BMP-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-IRES-BMP-2經(jīng)酶切電泳分析和序列測定，插入的BMP-2片段與GeneBank中BMP-2序列完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功。將包裝細(xì)胞PT67包裝形成的Cbfa1、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒分別

16、感染牙囊細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)Cbfa1、BMP-2的牙囊細(xì)胞。感染細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光，實(shí)時RT-PCR發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞中，目的基因表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)，是正常和空載體感染細(xì)胞的5倍，并能檢測到相應(yīng)蛋白的表達(dá)。 實(shí)時RT-PCR分析顯示，Cbfa1感染牙囊細(xì)胞中BSP、OPN、ColI和CAP的表達(dá)強(qiáng)于BMP-2感染牙囊細(xì)胞(P＜0.01)，而BMP-2感染牙囊細(xì)胞中CP23的表達(dá)高于Cbfa1感染

17、牙囊細(xì)胞(P＜0.01)。超表達(dá)Cbfa1、BMP-2牙囊細(xì)胞中，ALP表達(dá)均有所降低(P＜0.01)，Cbfa1對ALP表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于BMP-2(P＜0.01)。Cbfa1和BMP-2對OC表達(dá)的影響均不明顯(P＞0.05)。 礦化結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)觀察到，Cbfa1感染牙囊細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的量明顯多于BMP-2感染牙囊細(xì)胞(P＜0.01)，BMP-2感染牙囊細(xì)胞中形成的礦化結(jié)節(jié)與正常牙囊細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體感染的牙囊無明顯差異

18、(P＞0.05)。 結(jié)論 1.用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了超表達(dá)Cbfa1、BMP-2的牙囊細(xì)胞。 2.Cbfa1可能通過調(diào)節(jié)成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)基因(OC、OPN、BSP、ColI、CAP、CP23等)的表達(dá)促進(jìn)牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化，而且刪除了轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)VWRPY元件的增強(qiáng)型Cbfa1的促進(jìn)能力更強(qiáng)。 3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)，牙囊細(xì)胞中超表達(dá)Cbfa1比BMP-2更能促進(jìn)成骨/