Cbfa1對小鼠牙囊細胞向成骨-成牙骨質(zhì)細胞分化的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景和目的：牙周病治療的最終目標是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復牙周組織的結構和功能，實現(xiàn)牙周組織的再生。組織的修復再生過程在很大程度上是生長發(fā)育過程的重演，因此明確組織形成的細胞學和分子學機制，對探索牙周組織再生非常重要。一般認為，牙周組織發(fā)生的前體細胞由牙囊細胞分化而來。研究表明，牙囊細胞中含有成牙骨質(zhì)細胞、牙周膜成纖維細胞和成骨細胞的前體細胞，在牙齒發(fā)育后期能形成牙骨質(zhì)、牙周膜及牙槽骨。因此，深入研究發(fā)育過程中調(diào)控牙囊細胞分

2、化的特異性因子及機制可為研究牙周組織再生所需要的細胞和分子提供重要的信息。 牙囊發(fā)育為成熟的牙周組織是一個非常復雜的過程，涉及多種細胞的分化，需要許多因子調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄因子核心結合因子α1(Cbfa1)，作為成骨細胞分化和骨發(fā)育的控制基因(mastergene)備受關注。Cbfa1對牙齒的發(fā)育同樣有重要作用。Cbfa1缺失鼠磨牙在帽狀早期停止發(fā)育，Cbfa1突變導致的顱鎖骨發(fā)育不良綜合征，除表現(xiàn)為骨形成異常外，也有很多牙齒疾患，

3、如多生牙，恒牙萌出延遲，細胞性牙骨質(zhì)缺失和牙根外形異常等。另外，Cbfa1在牙囊和牙乳頭中都有表達，而且隨著牙齒的進一步發(fā)育和牙根、牙周組織的形成，Cbfa1的表達更為明顯，在成牙骨質(zhì)細胞、牙骨質(zhì)細胞、牙周韌帶成纖維細胞和成骨細胞中都有表達。這表明Cbfa1參與牙周細胞的分化和牙周組織的形成。 研究發(fā)現(xiàn)，非成骨細胞中Cbfa1超表達能誘導成骨特異性基因表達，如Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(O

4、C)、堿性磷酸酶(ALP)等；成骨細胞中，用反義核酸干擾Cbfa1表達抑制了成骨細胞分化標記基因的表達和礦化結節(jié)的形成；而且，多種成骨細胞相關基因的啟動子都具有Cbfa1結合位點。這些基因都是成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞的重要組分，表明Cbfa1可能通過調(diào)控這些成骨/成牙骨質(zhì)相關基因的表達對成骨細胞/成牙骨質(zhì)細胞有重要作用。然而，Cbfa1對牙周組織的發(fā)育，對分化形成牙周組織的牙囊細胞的調(diào)控作用尚不明確。 骨形成蛋白-2(bonemo

5、rphogenicprotein-2，BMP-2)是轉(zhuǎn)錄生長因子-β超家族的成員之一，是研究最多的牙周組織再生的促進因子之一。研究表明，BMP-2能有效促進骨和牙骨質(zhì)形成。然而，BMP-2半衰期短，靶向性差，能擴散作用于周圍的非骨組織，而且靶細胞表面需要特異性受體和輔助因子，這些都限制了BMP-2功能的發(fā)揮。目前，牙周組織再生中，BMP-2的應用需要進一步的深入研究。 因此，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，將Cbfa1導入牙囊細胞，使

6、其在牙囊細胞中穩(wěn)定超表達，觀察Cbfa1對牙囊細胞分化的調(diào)控作用。同時比較Cbfa1和BMP-2轉(zhuǎn)染牙囊細胞的生物學活性，以期為牙周組織發(fā)育和牙周組織再生提供一定的細胞分子生物學信息。 材料和方法 1.Cbfa1在小鼠牙囊細胞中的表達 取出生后5～7天BALB/c小鼠，分離解剖含下頜第一磨牙牙胚的下頜骨，制備組織切片，采用免疫組化和原位雜交方法，觀察Cbfa1蛋白和mRNA在牙囊細胞中的組織學定位；隨后體視顯微鏡

7、下取出生后5～7天BALB/c小鼠下頜第一磨牙的牙囊組織，原代培養(yǎng)牙囊細胞，分別提取牙囊細胞的總RNA和蛋白，采用RT-PCR和Westernblot法觀察Cbfa1mRNA和蛋白在體外培養(yǎng)牙囊細胞中的表達情況。 2.超表達Cbfa1對牙囊細胞向成骨/成牙骨質(zhì)細胞方向分化的影響 構建Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLEGFP-IRES-Cbfa1，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞PT67，G418篩選獲得穩(wěn)定的產(chǎn)毒細胞株；

8、然后用含Cbfa1病毒的培養(yǎng)液感染牙囊細胞，抗生素篩選獲得穩(wěn)定超表達Cbfa1的牙囊細胞；采用實時RT-PCR檢測超表達Cbfa1對牙囊細胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關基因的作用，包括ALP、OC、OPN、BSP、ColI、牙骨質(zhì)附著蛋白(cementumattachmentprotein，CAP)和牙骨質(zhì)蛋白(cementum-derivedprotein23，CP23)等，同時采用體外礦化結節(jié)形成實驗檢測超表達Cbfa1對牙囊細胞體外礦化能

9、力的影響，實驗以正常牙囊細胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細胞作對照。 通過刪除Cbfa1轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)VWRPY元件構建增強型Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLEGFP-IRES-Cbfa1(E)，并獲得穩(wěn)定超表達增強型Cbfa1的牙囊細胞，觀察增強型Cbfa1對牙囊細胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關基因的作用和對牙囊細胞體外礦化能力的影響。 3.牙囊細胞中Cbfa1、BMP-2超表達對成骨/成牙骨質(zhì)相關基因表達影響的比較 構建

10、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒，并用Cbfa1、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染牙囊細胞，獲得穩(wěn)定超表達Cbfa1、BMP-2的牙囊細胞。采用實時RT-PCR和體外礦化結節(jié)形成實驗檢測并比較超表達Cbfa1和BMP-2對牙囊細胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關基因的作用和對牙囊細胞體外礦化能力的影響。實驗以正常牙囊細胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細胞作對照。 結果 1.Cbfa1在小鼠牙囊細胞中的表達 出生后5-7天BALB/c小鼠下頜第

11、一磨牙牙胚處于鐘狀晚期，上皮根鞘清晰可見，牙根還沒有開始發(fā)育，牙囊組織疏松的環(huán)繞在成釉器周圍。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，Cbfa1mRNA在牙囊細胞的胞漿中有表達，但Cbfa1蛋白在牙囊組織中未見表達。對體外培養(yǎng)的牙囊細胞，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Cbfa1mRNA在培養(yǎng)牙囊細胞中陽性表達，Westernblot檢測未見Cbfa1蛋白表達，與體內(nèi)牙囊細胞的檢測結果相一致。 2.超表達Cbfa1促進牙囊細胞向成骨/成牙骨質(zhì)細胞方向分化的影響

12、 構建的Cbfa1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLEGFP-IRES-Cbfa1經(jīng)酶切電泳分析和序列測定，插入的Cbfa1片段與GeneBank中Cbfa1序列完全一致，質(zhì)粒構建成功。將包裝細胞PT67包裝形成的Cbfa1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牙囊細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定超表達Cbfa1的牙囊細胞。感染細胞在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光，實時RT-PCR發(fā)現(xiàn)Cbfa1病毒感染細胞中Cbfa1mRNA表達量明顯升高(P＜0.01)，是正常和空載體感

13、染細胞的5～10倍，并能檢測到Cbfa1蛋白表達，穩(wěn)定超表達Cbfa1的牙囊細胞構建成功。 牙囊細胞中可檢測到成骨/成牙骨質(zhì)相關基因(ColI、ALP、OPN、BSP、OC、CAP和CP23)的表達。Cbfa1超表達牙囊細胞中成骨/成牙骨質(zhì)相關基因(OC、BSP、OPN、ColI、CAP和CP23)的表達顯著高于正常牙囊細胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的牙囊細胞(P＜0.01)；而ALP的表達受到抑制(P＜0.01)。Cbfa1(E)

14、對部分成骨/成牙骨質(zhì)相關基因(OC、OPN、ColI和CP23)表達的促進作用強于Cbfa1(P＜0.01)，而Cbfa1對CAP的促進作用強于Cbfa1(E)(P＜0.01)，二者對BSP和ALP的作用無明顯差異(P＞0.05)。 礦化結節(jié)形成實驗觀察到，牙囊細胞和病毒感染牙囊細胞中均有黑褐色的礦化結節(jié)形成，且隨著培養(yǎng)時間增長，形成的礦化結節(jié)逐漸增多。Cbfa1感染牙囊細胞中，礦化結節(jié)的量明顯多于正常牙囊細胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空

15、載體的牙囊細胞(P＜0.01)，而Cbfa1(E)對礦化結節(jié)形成的增強能力大于Cbfa1(P＜0.05)。 3.牙囊細胞中Cbfa1、BMP-2超表達對成骨/成牙骨質(zhì)相關基因表達影響的比較 BMP-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLEGFP-IRES-BMP-2經(jīng)酶切電泳分析和序列測定，插入的BMP-2片段與GeneBank中BMP-2序列完全一致，質(zhì)粒構建成功。將包裝細胞PT67包裝形成的Cbfa1、BMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒分別

16、感染牙囊細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定超表達Cbfa1、BMP-2的牙囊細胞。感染細胞在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光，實時RT-PCR發(fā)現(xiàn)感染細胞中，目的基因表達量明顯升高(P＜0.01)，是正常和空載體感染細胞的5倍，并能檢測到相應蛋白的表達。 實時RT-PCR分析顯示，Cbfa1感染牙囊細胞中BSP、OPN、ColI和CAP的表達強于BMP-2感染牙囊細胞(P＜0.01)，而BMP-2感染牙囊細胞中CP23的表達高于Cbfa1感染

17、牙囊細胞(P＜0.01)。超表達Cbfa1、BMP-2牙囊細胞中，ALP表達均有所降低(P＜0.01)，Cbfa1對ALP表達的抑制作用強于BMP-2(P＜0.01)。Cbfa1和BMP-2對OC表達的影響均不明顯(P＞0.05)。 礦化結節(jié)形成實驗觀察到，Cbfa1感染牙囊細胞中礦化結節(jié)的量明顯多于BMP-2感染牙囊細胞(P＜0.01)，BMP-2感染牙囊細胞中形成的礦化結節(jié)與正常牙囊細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體感染的牙囊無明顯差異

18、(P＞0.05)。 結論 1.用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)，成功構建了超表達Cbfa1、BMP-2的牙囊細胞。 2.Cbfa1可能通過調(diào)節(jié)成骨/成牙骨質(zhì)相關基因(OC、OPN、BSP、ColI、CAP、CP23等)的表達促進牙囊細胞向成骨細胞/成牙骨質(zhì)細胞方向分化，而且刪除了轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)VWRPY元件的增強型Cbfa1的促進能力更強。 3.應用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)，牙囊細胞中超表達Cbfa1比BMP-2更能促進成骨/