重組腺病毒BMP-9對牙囊干細(xì)胞成骨向誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、牙周炎作為人類最普遍、最古老的疾病之一，是一種慢性感染性疾病;牙菌斑中的微生物引起牙齒支持組織形成炎癥、產(chǎn)生深牙周袋、附著喪失與牙槽骨的垂直性或水平性吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動和脫落;也是成年人牙齒缺失的主要原因[4]。牙周骨缺損修復(fù)和正常生理結(jié)構(gòu)與生理功能的重建是牙周炎治療的最終目的，目前對骨上袋缺損的再生性修復(fù)尚缺乏行之有效的治療手段，不可能實(shí)現(xiàn)真正意義上的牙周生物學(xué)修復(fù)。牙源性干細(xì)胞與牙周組織工程技術(shù)為新的生物性修復(fù)再生牙周組織及其牙

2、齒提供了可能，即用細(xì)胞工程和生物工程化的方法實(shí)現(xiàn)牙周組織再生，形成新附著。應(yīng)用牙源性干細(xì)胞和組織工程技術(shù)，按照牙周組織生長與發(fā)育的基本原理和基本方法來模擬再現(xiàn)牙周組織整個(gè)發(fā)育過程才能真正地實(shí)現(xiàn)牙周組織再生。
　　 再生組織工程中，種子細(xì)胞的選擇具有決定性意義;細(xì)胞獲取方便，移植入機(jī)體后細(xì)胞生物學(xué)活性穩(wěn)定，分化增殖能力強(qiáng)等是理想種子細(xì)胞必備條件。發(fā)育形成牙周組織的牙囊是一種疏松結(jié)締組織，起源于外胚間充間充質(zhì)，包繞著牙胚期的成釉器和

3、牙乳頭。一般認(rèn)為牙周分泌牙骨質(zhì)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞由靠近正在形成中牙根的牙囊最內(nèi)層細(xì)胞發(fā)育而成，而牙周組織中分泌骨基質(zhì)、形成部分牙槽骨的成骨細(xì)胞是鄰近牙槽骨的外層牙囊細(xì)胞發(fā)育而成;成纖維細(xì)胞由中間層牙囊細(xì)胞發(fā)育，產(chǎn)生牙周膜纖維。作為牙周組織前體細(xì)胞的牙囊細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化能力的干細(xì)胞特性與異質(zhì)性，如果能將牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cells，DFCs)分離出來，這對研究牙周組織的生長發(fā)育形成起著至關(guān)重要

4、的作用;對牙齒移植、牙再植及牙再生均具有重要的指導(dǎo)意義;DFCs較強(qiáng)的增殖分化能力也使其成為一種值得考慮的組織工程候選種子細(xì)胞。
　　 骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）是一類糖蛋白，在骨的發(fā)育和塑建中起著關(guān)鍵性作用，可通過多種途徑多種方式促進(jìn)細(xì)胞向成骨部位定向趨化、募集和促進(jìn)成骨細(xì)胞定向分化，促進(jìn)血管的生成和組織血管化形成，調(diào)節(jié)多種局部生長因子的活性，影響生長因子的形成，促進(jìn)骨組織的

5、形成。在已知對骨再生有促進(jìn)作用的生長因子中，BMPs是最強(qiáng)的生長因子，目前已經(jīng)分離出20余種，其中已報(bào)道具有成骨潛能是BMPs2、4、6、7、9;BMP9具有誘導(dǎo)和維持胚胎神經(jīng)元的類膽堿分化功能，能夠調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和葡萄糖代謝，能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵離子的動態(tài)平衡等多種重要生物學(xué)功能，但長期以來人們?nèi)狈ρ芯亢土私釨MP9在骨形成和骨再生中的作用。TC HE系統(tǒng)研究了在骨形成過程中的BMP2至BMP15共14種BMPs所起的生物學(xué)作用，結(jié)果表明這

6、14種BMPs中，BMP9具有很強(qiáng)的促進(jìn)軟骨形成與成骨活性，作用強(qiáng)于BMP2和BMP7，也是BMPs家族中促進(jìn)成骨分化的生長因子之一，極具研究潛力和應(yīng)用前景[64，65];但在口腔成骨方面和對DFCs的影響未見相關(guān)報(bào)道。
　　 DFCs具有成脂肪、成骨、成神經(jīng)等多向分化潛能的干細(xì)胞特征，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，可以多向分化。然而，由于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控和信號通路的復(fù)雜性以及研究手段的限制，DFCs的具體分化調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究旨

7、在著力探討重組腺病毒BMP-9基因轉(zhuǎn)染大鼠DFCs的可行性及其轉(zhuǎn)染后的成骨向分化與作用機(jī)制，以獲得可用于牙周骨組織再生工程的基因修飾的種子細(xì)胞，為后續(xù)牙周組織工程治療口腔骨缺損奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　 1.在解剖顯微鏡下，從SD大鼠下頜骨牙胚上剝離牙囊，組織塊法和酶消化獲取牙囊細(xì)胞原代培養(yǎng)、有限稀釋法克隆純化、細(xì)胞表型鑒定，成骨、成脂肪多向誘導(dǎo)分化，結(jié)果表明:DFCs具有成骨、成脂肪等多向分化潛能的干細(xì)胞特征，在

8、定向成骨誘導(dǎo)分化過程中，沒有出現(xiàn)成脂肪向分化。
　　 2.腺病毒介導(dǎo)的BMP-9轉(zhuǎn)染第三代DFCs，設(shè)立空白對照組，綠色熒光病毒組（GFP組）、BMP組，成骨誘導(dǎo)組、聯(lián)合組。通過觀察細(xì)胞形態(tài)和MTT生長曲線變化、熒光顯微鏡及RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后BMP-9基因mRNA的表達(dá);堿性磷酸酶ALP活性、ALP染色及鈣茜素紅染色測定轉(zhuǎn)染后DFCs的早晚期成骨活性。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染的DFCs穩(wěn)定表達(dá)BMP-9，說明轉(zhuǎn)染后的BMP-9基因能成

9、功被轉(zhuǎn)錄并表達(dá)于DFCs;與未轉(zhuǎn)染對照組相比較，轉(zhuǎn)染組ALP染色及茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色為陽性;轉(zhuǎn)染組顯著高于未轉(zhuǎn)染組，說明DFCs有良好的骨向分化能力，也提示了BMP-9對DFCs有成骨誘導(dǎo)作用。
　　 3.應(yīng)用抑制劑p38蛋白激酶抑制劑SB203580和ERK1/2激酶抑制劑PD98059干擾BMP-9轉(zhuǎn)染的DFCs，用來阻斷p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)胞內(nèi)信號傳遞，通過ALP活性

10、及染色檢測;Western blot分析;鈣茜素紅染色實(shí)驗(yàn)分析MAPKs信號通路對BMP-9誘導(dǎo)的DFCs成骨向分化過程中的調(diào)控和影響。結(jié)果表明:抑制MAPKp38的表達(dá)后降低了Ad-BMP-9誘導(dǎo)的DFCs的ALP的活性和ALP染色，且減少了鈣鹽沉積與骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和骨鈣素(osteocalin，OCN)的表達(dá);抑制ERK1/2的活性后則相反。同時(shí)，Western blot分析顯示Smad和MAPK通路激活

11、，表明BMP誘導(dǎo)DFCs成骨向分化涉及到兩條或可能更多的信號通路激活。研究結(jié)論:
　　 1.成功獲得了大鼠DFCs克隆，合適誘導(dǎo)條件下能夠多向誘導(dǎo)分化。
　　 2.在腺病毒BMP-9轉(zhuǎn)染DFCs實(shí)驗(yàn)中，通過RT-PCR可檢測到轉(zhuǎn)染后BMP-9基因mRNA的表達(dá)，堿性磷酸酶和鈣茜素紅染色測定轉(zhuǎn)染后DFCs的早期和晚期成骨活性，說明BMP-9可以成功地轉(zhuǎn)染大鼠DFCs，轉(zhuǎn)染后DFCs高表達(dá)BMP-9，且具有明顯的成骨作用。<