機(jī)械牽張力誘導(dǎo)低表達(dá)Cbfa1基因的人牙周膜細(xì)胞成骨分化基因調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、牙周膜成纖維細(xì)胞（PDLF）是牙周膜組織中數(shù)量最多，功能最重要的細(xì)胞。牙周膜細(xì)胞是一種具有多向分化功能的群體細(xì)胞，在發(fā)育過程和生理應(yīng)力作用下，部分細(xì)胞會(huì)分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞。牙周膜細(xì)胞具有趨化、粘附、增生、生物合成和形成礦化組織等多項(xiàng)生物學(xué)功能。這些功能受許多正、負(fù)調(diào)節(jié)因素的影響，其中機(jī)械力是一種重要的影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的外界刺激因子。機(jī)械力對牙周改建作用影響較大，其對于牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性的影響近年來受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，以往研

2、究表明牙周膜細(xì)胞具有成骨樣細(xì)胞表型特征，在機(jī)械力作用下可以向成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，還有研究表明機(jī)械力可以調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性，影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝，誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。 RNAi（RNA interference）即RNA干擾，是近幾年發(fā)展起來的一種研究基因功能的新方法，是一種雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的基因沉默（gene silencing），在此過程中，與雙鏈RNA

3、有同源序列的信使RNA（mRNA）被高效特異性的降解，從而抑制該基因的表達(dá)。由于RNAi技術(shù)可以利用siRNA或siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。目前有關(guān)機(jī)械力調(diào)控細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚未十分明確，但可以肯定的是一些生物分子在時(shí)間、空間、活性強(qiáng)度等方面有序的協(xié)調(diào)作用決定了牙周組織改建的進(jìn)程，如生長因子和相關(guān)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞膜表面成分和粘附分子等。

4、細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為進(jìn)一步深入研究該機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 本研究首先設(shè)計(jì)針對Cbfa1 基因編碼區(qū)的寡核苷酸鏈，體外退火后克隆入經(jīng)雙酶切線性化的小干擾載體mU6 中，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析和DNA序列測定。以脂質(zhì)體法將mU6 空載體和重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入hPDLCs 細(xì)胞系。 用含G418 的培養(yǎng)液篩選，挑取陽性克隆后用RT-PCR 技術(shù)檢測各人牙周膜細(xì)胞克隆內(nèi)Cbfa1 mRNA 水平的表達(dá)情況。

5、結(jié)果表明：經(jīng)酶切鑒定及DNA 測序，重組質(zhì)粒Cbfa1-siRNA 中插入的目的基因（特異寡核苷酸）片段與預(yù)計(jì)片段完全一致。G418 篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞4wk 后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mU6 空載體的細(xì)胞克隆株hPDLCs-mU6 和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞克隆株hPDLCs-siRNA。 經(jīng)RT-PCR 鑒定，Cbfa1 在hPDLCs-siRNA 細(xì)胞中的表達(dá)比對照細(xì)胞明顯降低。因而成功構(gòu)建了針對Cbfa1 的小干擾RNA 載體，成功建立了

6、穩(wěn)定的低表達(dá)Cbfa1 的人牙周膜細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究Cbfa1 的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 為了進(jìn)一步探討周期性牽張力對低表達(dá)Cbfa1 基因的人牙周膜細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)作用，選擇成骨分化基因Ⅰ型膠原、OCN、OPG 作為研究指標(biāo)，利用本科室自行研制的多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的低表達(dá)Cbfa1 基因人牙周膜細(xì)胞施加12％形變率、0.1HZ 周期性牽張力6，12，24小時(shí)，對照組細(xì)胞不加力，實(shí)時(shí)定量RT—PCR 檢測其

7、成骨分化基因表達(dá)的時(shí)序性變化。結(jié)果體外培養(yǎng)低表達(dá)Cbfa1 基因人牙周膜細(xì)胞成骨分化基因的表達(dá)量均較低，加力6，12，24 小時(shí)后Ⅰ型膠原、OCN 基因表達(dá)依次升高，并且隨著加力時(shí)間的增加而產(chǎn)生時(shí)序性的遞增；而OPG 基因表達(dá)則在加力的過程中有所下調(diào)，該研究進(jìn)一步表明利用自行研制的多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)加載的周期性牽張力可以誘導(dǎo)低表達(dá)Cbfa1 基因人牙周膜細(xì)胞向成骨方向分化。 綜上所述，我們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力