microRNA和apelin調(diào)控血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化和凋亡.pdf

1、第一部分 microRNA-204調(diào)控血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化
　　 目的:動脈中膜鈣化是一種常見的大血管病變，它起始于血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨樣細胞分化的主動調(diào)節(jié)過程。目前調(diào)控這一過程的具體機制還不清楚。特定的microRNA可能通過表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞(osteoblast-like cells)分化。在本實驗中，我們主要探討m

2、iR-204是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化。
　　 方法:以β-甘油磷酸鈉干預(yù)小鼠原代血管平滑肌細胞，以實時定量PCR檢測miR-204表達水平的改變，以蛋白免疫印跡雜交檢測Runx2表達水平的改變。以miR-204 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細胞，以蛋白免疫印跡雜交檢測Runx2表達水平的改變，并檢測以β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)后成骨性標(biāo)志物ALP和OC及Runx2蛋白表達水平的改變。將野生型／突變

3、型Runx23’-UTR與miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細胞，以熒光素酶報告基因策略驗證Runx2是否為miR-204的直接作用靶點。
　　 結(jié)果:β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下小鼠血管平滑肌細胞發(fā)生成骨樣細胞分化，其miR-204表達水平受抑制而Runx2表達水平上調(diào)。以miR-204 mimics轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細胞能降低Runx2蛋白水平并抑制β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細胞分化，而以miR-204抑制劑轉(zhuǎn)染的小鼠

4、血管平滑肌細胞能上調(diào)Runx2蛋白水平并增強β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細胞分化，提示在血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化過程中miR-204為Runx2的內(nèi)源性抑制劑。通過熒光素酶報告基因策略驗證Runx2為miR-204的直接作用靶基因。
　　 結(jié)論: miR-204表達水平的下調(diào)，從而上調(diào)Runx2蛋白表達水平為β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化發(fā)生的始動因素。miR-204為血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化過程中

5、關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。
　　 第二部分調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化的新microRNA克隆及其功能研究
　　 目的:血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨樣細胞分化在許多血管鈣化疾病的病理過程中起關(guān)鍵作用。近期研究表明，microRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞鈣化過程。本研究的目的在于探尋在血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用的新的miRNA。

6、
　　 方法:從小鼠原代血管平滑肌細胞抽提小RNA。經(jīng)過Poly(A)加尾并連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行PCR擴增、回收，連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建小分子RNA的cDNA文庫，最后進行菌落PCR，得到陽性克隆送測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析確定新的miRNA(miR-X)，并以Northern印記雜交驗證。以生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-X的作用靶基因。通過轉(zhuǎn)染miR-X前體（功能獲得研究）和miR-X抑制劑（功

7、能缺失研究）調(diào)節(jié)miR-X的表達水平。測定轉(zhuǎn)染前后血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化程度和靶基因表達水平的改變。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)了主要表達于血管平滑肌細胞的新miRNA——miR-X，并發(fā)現(xiàn)它的表達水平在血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化過程中表達減少。轉(zhuǎn)染pre-miR-X能減少β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)血管平滑肌細胞ALP活性、骨鈣素分泌、Runx2蛋白表達和礦化水平，而轉(zhuǎn)染miR-X抑制劑能增加血管平滑肌細胞ALP活性、骨鈣素分泌和

8、Runx2蛋白表達水平。通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測FosB為miR-X的直接作用靶基因。miR-X過表達能下調(diào)FosB蛋白表達水平，對FosBmRNA表達水平卻無影響。
　　 結(jié)論:miR-X表達水平的下調(diào)通過作用于靶基因FosB參與調(diào)節(jié)β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化過程。
　　 第三部分Apelin通過APJ/PI3-K/Akt信號通路抑制人血管平滑肌細胞凋亡
　　 目的:血管平滑肌細胞(vas

9、cular smooth muscle cells，VSMCs)的凋亡在心血管疾病中的血管重塑方面起重要的調(diào)控作用。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。但是apelin是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞凋亡過程仍未可知。本實驗將以人原代血管平滑肌細胞為模型，探討apelin對人血管平滑肌細胞凋亡的作用及參與調(diào)節(jié)的信號通路。
　　 方法:以Western免疫印跡檢測APJ在血管平滑肌細胞中的表達水平

10、。以血清饑餓法誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡，以apelin重組蛋白干預(yù)細胞，以細胞凋亡ELISA檢測法及TUNEL法檢測細胞凋亡水平。以siRNA沉默血管平滑肌細胞APJ的表達后，再檢測apelin對細胞凋亡的影響。以Western免疫印跡檢測apelin對Bcl-2、Bax蛋白及MAPK、Akt磷酸化水平的影響，再檢測使用相應(yīng)的信號通路阻斷劑及APJ的siRNA后信號通路的激活及細胞凋亡水平的變化。
　　 結(jié)果:Western免疫印

11、跡檢測出APJ在人原代血管平滑肌細胞中表達。Apelin能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的人血管平滑肌細胞凋亡。通過siRNA沉默APJ的表達能阻斷apelin的抗凋亡作用。apelin上調(diào)Bcl-2的表達，下調(diào)Bax的表達。apelin還能激活ERK(extra-cellularsignal-regulated protein kinase，細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)和Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶下游效應(yīng)物）信號通路。APJ的siRNA能阻斷apel