人合子重構(gòu)與卵子激活的初步研究.pdf

1、作為生物學(xué)發(fā)展史上最偉大的成就之一，核移植技術(shù)是發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究的有力工具，在研究配子和胚胎發(fā)生、基因表達(dá)調(diào)控和核質(zhì)互作等方面作用重要。核移植與人類生殖研究領(lǐng)域密切相關(guān)。 治療性克隆即利用體細(xì)胞核移植得到的人囊胚建立病人個體化的人ES細(xì)胞系，是體細(xì)胞核移植技術(shù)與干細(xì)胞技術(shù)的結(jié)合，是治療一些退行性疾病的新希望，也是當(dāng)今生命科學(xué)最熱門的領(lǐng)域之一。 此外，隨著婦女年齡的增長，女性卵子質(zhì)量明顯地降低。卵漿質(zhì)量下降的原因之一可能

2、是抗凋亡因子和促凋亡因子失衡，線粒體膜電勢缺陷。人們推測補(bǔ)充健康供卵卵漿可望復(fù)原受體卵漿質(zhì)量。通過細(xì)針注射胞漿移植治療，可在非常低妊娠率的人群中獲得大于50％的妊娠率，但其作用機(jī)制、有效性和可能存在的危險卻仍缺乏深入研究。采用顯微操作技術(shù)將合子原核從老齡婦女受精卵中分離出來并與已去除原核的年輕婦女受精卵卵漿進(jìn)行融合的原核移植是最為徹底的核-質(zhì)置換方式，可避免細(xì)針注射胞漿技術(shù)存在的各種問題。通過該技術(shù)，可利用輔助生育治療中廢棄的胚胎構(gòu)建成

3、核-質(zhì)異質(zhì)重構(gòu)胚，并結(jié)合干細(xì)胞技術(shù)得到相應(yīng)的胚胎干細(xì)胞。當(dāng)它們應(yīng)用于單純的科學(xué)研究，是研究核-質(zhì)關(guān)系的良好模型。 細(xì)胞核移植的效率與重構(gòu)卵的電融合以及激活的效率緊密相關(guān)。 提高融合率，是提高核移植效率的主要途徑之一。電融合的原理是依據(jù)細(xì)胞膜的液態(tài)性，在短時程的高電脈沖作用下引起膜的流動狀態(tài)，使2個相互接觸的細(xì)胞膜融合在一起。電融合效率受到融合液組成(主要是受滲透壓)、脈沖性質(zhì)(強(qiáng)度、數(shù)量和持續(xù)時間)的影響。 在精

4、子或某些理化因素的刺激下，卵母細(xì)胞恢復(fù)并完成減數(shù)分裂，這一過程稱為卵母細(xì)胞激活。利用理化因素的卵子激活即卵母細(xì)胞的人工激活，卵子人工激活得到的胚胎是人工孤雌生殖的產(chǎn)物。不同激活方法的激活機(jī)理基本是一致的，最終目的均是要將停止在MII階段的卵母細(xì)胞恢復(fù)分裂周期，這就必須使胞內(nèi)的MPF和CSF的活性降低或消失。激活途徑有兩種，一是鈣離子信號通路，鈣離子載體和電刺激等是通過激發(fā)單脈沖性鈣離子升高而實(shí)現(xiàn)的。二是Mos/MAPK通路，蛋白質(zhì)合成抑

5、制劑、蛋白磷酸化抑制劑等通過調(diào)節(jié)蛋白激酶或蛋白磷酸酶活性，降調(diào)MPF、CSF而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活。 人類體細(xì)胞核移植技術(shù)效率的提高對治療性克隆的發(fā)展有巨大的促進(jìn)作用，然而目前人體細(xì)胞核移植的效率非常低，成為治療性克隆發(fā)展的瓶頸，受體卵母細(xì)胞未被充分激活可能是癥結(jié)之一。受到倫理道德的約束，且人源性配子非常珍貴，來源非常有限，都制約了人類核移植技術(shù)的發(fā)展。另一方面，雖然綿羊、牛、小鼠等哺乳動物體細(xì)胞核移植的成功為人的研究提供了可貴的參

6、考，但它們與人的機(jī)制與構(gòu)造畢竟有物種差異，而目前關(guān)于人類體細(xì)胞核移植的研究尚無確實(shí)報道，因此進(jìn)一步摸索人類體細(xì)胞核移植，特別是電融合/電激活的操作細(xì)節(jié)和實(shí)驗條件非常重要。 本研究通過摸索不同階段卵子的電融合/電激活方法，對人合子重構(gòu)與卵子激活進(jìn)行了的初步探討，建立了利用多原核受精卵通過原核移植構(gòu)建核-質(zhì)異質(zhì)胚的方法，優(yōu)化了人卵母細(xì)胞孤雌激活的方案。 第一部分：人原核期合子重構(gòu)的初步研究 [研究目的]利用人多原核受

7、精卵為材料，摸索人類配子進(jìn)行電融合/電激活操作的具體技術(shù)細(xì)節(jié)，從電融合條件的優(yōu)化著眼探索人原核移植技術(shù)和構(gòu)建核-質(zhì)異構(gòu)胚胎模型的方法，為研究人類核質(zhì)間相互關(guān)系以及探討胞漿移植技術(shù)的機(jī)制提供實(shí)驗依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 [材料和方法](一)材料在受精后16-19h，在倒置顯微鏡下觀察和記錄在本生殖中心行常規(guī)體外授精與胚胎移植(IVF-ET)周期病人胚胎的極體(polarbody，PB)排出及原核(pronuclear，PN)形成情況，認(rèn)為

8、形態(tài)為3(或以上)PN+2PB者為多原核受精卵。經(jīng)病人簽署知情同意，共收集多原核受精卵83個納入本研究。 (二)實(shí)驗設(shè)計分別比較不同電融合液和不同電場條件對原核移植重構(gòu)合子融合率和發(fā)育的影響： 在含鈣離子濃度一定的融合液中，在電脈沖次數(shù)和脈時一定的條件下，分別用1800v/cm和2000v/cm的電壓融合重構(gòu)合子，比較不同電壓對原核移植重構(gòu)合子融合率和發(fā)育的影響。 在電脈沖一定的條件下，分別用不同的融合液(A液：

9、含0.05mM氯化鈣；B液：含0.1mM氯化鈣)融合重構(gòu)合子，比較不同鈣離子濃度的融合液對重構(gòu)合子融合率和發(fā)育的影響。 (三)實(shí)驗方法在完成顯微操作針和原核期合子的準(zhǔn)備后，對目的多原核受精卵進(jìn)行顯微操作，再將構(gòu)建的核-質(zhì)異質(zhì)胚行電融合操作。最后，對重構(gòu)合子進(jìn)行序貫的體外培養(yǎng)。 [結(jié)果]1.共操作多原核受精卵83個，操作成功60個，操作成功率為72.3％。行電融合60個，融合成功33個，平均融合成功率為55.0％。共卵裂3

10、1個，6細(xì)胞以上者17，6細(xì)胞數(shù)占卵裂數(shù)54.8％。共有10個重構(gòu)合子發(fā)育至8細(xì)胞或以上，其中2個發(fā)育為囊胚。 2.比較電融合時不同電壓數(shù)對原核移植重構(gòu)合子融合率和發(fā)育的影響將電壓數(shù)由2000v/cm下降到1800v/cm，重構(gòu)合子融合率(75.0％vs65.0％)、卵裂率(100％vs84.6％)和6-細(xì)胞率都沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但6-細(xì)胞以上胚胎數(shù)則有上升趨勢。 3.比較0.05mM和0.1mM鈣離子濃度的融合液對原核移

11、植重構(gòu)合子融合率和發(fā)育的影響 鈣離子濃度為0.05mM的融合液和0.1mM者比較，融合率(39.3％vs65.0％)、卵裂率(100％vs84.6％)、6-細(xì)胞率(63.6％vs72.7％)和囊胚率(18.2％vs0)皆無明顯差異，但鈣離子濃度升高有促進(jìn)融合率(65.0％vs.39.3％)的趨勢。 第二部分：人卵母細(xì)胞孤雌激活方法初探 [研究目的]為建立較為理想的人卵母細(xì)胞人工激活方法，比較不同孤雌激活方案和不同

12、來源人卵母細(xì)胞的孤雌激活效率，并觀察隨后的孤雌發(fā)育，為進(jìn)一步探索核移植激活條件、提高人類體細(xì)胞核移植效率及進(jìn)行胚胎孤雌發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)。 [材料和方法]一、材料經(jīng)知情同意，本生殖中心行ICSI患者，取卵當(dāng)天未成熟卵體外培養(yǎng)后成熟期卵子53個(IVM)；另外有24個由健康生育期女性捐贈的體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞(IVP)。 二、實(shí)驗設(shè)計分別用電-化序貫激活法和單獨(dú)化學(xué)激活法(離子霉素聯(lián)合6-DMAP)處理IVM人卵母細(xì)胞，探討兩

13、種方法在激活效率和孤雌胚發(fā)育潛力上的差異。 以供胚胎干細(xì)胞研究的贈卵受精后胚胎為對照，比較IVP卵母細(xì)胞孤雌胚胎與受精胚胎發(fā)育潛能的差異。 分別用電-化序貫激活法處理人IVP卵母細(xì)胞和人IVM卵母細(xì)胞，比較不同來源卵母細(xì)胞的激活率及其孤雌胚的發(fā)育能力。 三、實(shí)驗方法在卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活和體外受精后，對胚胎體外培養(yǎng)和常規(guī)觀察。 [實(shí)驗結(jié)果]對53個人體外成熟卵母細(xì)胞行孤雌激活，共激活31個，對24個人體內(nèi)

14、成熟卵母細(xì)胞行孤雌激活，共激活17個。 進(jìn)行孤雌激活的人卵母細(xì)胞大致遵循常規(guī)體外受精(IVF)胚胎發(fā)育時程，最早在激活后4-5h可見原核出現(xiàn)，可見1原核1極體(1PN+1PB)，2原核1極體(2PN+1PB)和1原核2極體(1PN+2PB)。 觀察IVM卵母細(xì)胞來源的孤雌囊胚和IVP卵母細(xì)胞來源的孤雌囊胚形態(tài)，可見IVM源性囊胚形態(tài)較差，囊胚腔較小，胚胎碎片多，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)不清楚、細(xì)胞數(shù)少；而IVP來源囊胚形態(tài)較好，囊胚腔較

15、大，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞形態(tài)好，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)清晰、細(xì)胞數(shù)多。 三、單獨(dú)化學(xué)激活法(A)和電-化序貫激活法(B)對人IVM卵母細(xì)胞孤雌激活的影響 兩種方法處理人IVM卵母細(xì)胞對激活率(61.9％vs56.3％)、卵裂率(84.6％vs66.7％)、4-細(xì)胞率(100％vs75.0％)皆無明顯差異，但用單獨(dú)化學(xué)激活法的孤雌胚發(fā)育皆停滯于4-細(xì)胞期，而用電-化序貫激活法的孤雌胚可跨越4-細(xì)胞期，發(fā)育至6-8細(xì)胞期，獲得一個囊胚。

16、 二、孤雌胚胎與受精胚胎發(fā)育潛能的比較 孤雌組與受精組胚胎卵裂率相同，激活率(受精率)和囊胚率無明顯差異。但孤雌組D3的優(yōu)質(zhì)胚胎率則明顯低于受精組。 三、用電-化序貫激活法處理人體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞(IVP)和人體外成熟卵母細(xì)胞(IVM)孤雌情況的比較 和IVM卵母細(xì)胞相比，IVP來源卵母細(xì)胞的激活率(70.8％vs56.3％)沒有明顯差異，但卵裂率明顯上升(66.7％vs.100％)。IVM來源孤雌胚75％停滯在4

17、-細(xì)胞期，僅得到一個囊胚；而IVP來源孤雌胚6-細(xì)胞以上者占70.6％，其中一半發(fā)育至囊胚。 [全文結(jié)論]1.首次建立了利用廢棄多原核受精卵通過原核移植構(gòu)建人雙倍體核-質(zhì)異質(zhì)胚的方法，證明了該方法是可行的、經(jīng)濟(jì)的。 2.通過改良電融合中電場強(qiáng)度和融合液配方，可改善人類原核移植重構(gòu)胚的重構(gòu)效率和發(fā)育潛能。 3.孤雌生殖受激活方案和卵子來源影響。電-化序貫激活法較單獨(dú)化學(xué)激活法對IVM卵子孤雌發(fā)育更有利。IVP卵母細(xì)