人卵子印跡基因H19和MEST甲基化狀態(tài)的實驗研究.pdf

1、目的： 基因印跡是指親本來源不同的一對等位基因表達活性不同的遺傳現(xiàn)象。印跡基因在促進胚胎生長發(fā)育、維持胎盤功能、促進神經(jīng)發(fā)育和心血管形成和調(diào)控神經(jīng)行為等方面起重要作用。甲基化是印跡的主要方式，已知的絕大多數(shù)印跡基因存在胞嘧啶差異性甲基化，即父源和母源等位基因中只有一個發(fā)生甲基化，甲基化的等位基因不表達。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，印跡基因在原始生殖細胞遷入生殖嵴的時候開始去甲基化，然后在生殖細胞分化成熟的各個階段逐漸重新甲基化而獲得印跡。這些

2、處于變化時期的印跡基因顯得十分脆弱而敏感，易受到外界環(huán)境如外源激素、體外操作、細胞培養(yǎng)等的影響而造成印跡異常。人類輔助生殖技術(shù)(ART)涉及激素的使用，也可能對人卵子的印跡產(chǎn)生影響。但人類促排卵后卵子的基因印跡改變的研究較少，尚沒有確切的結(jié)論。亞硫酸氫鈉測序是卵子印跡基因甲基化研究中廣為使用的方法，但報道的PCR(polymerasechainreaction)成功率都較低。本實驗通過改進單細胞低熔點瓊脂糖包埋和亞硫酸氫鈉處理的方法，采

3、用半巢式PCR的方法擴增人單個卵細胞父源印跡基因H19和母源印跡基因MEST，大大提高PCR擴增成功率。本實驗還對獲得的PCR產(chǎn)物克隆測序明確H19和MEST的甲基化狀態(tài)，通過比較自然周期及超促排周期各級卵子的甲基化情況，探討人卵子H19和MEST基因印跡建立的時序以及超促排卵對印跡建立及維持的影響，旨在進一步研究ART對基因印跡的影響，為提高ART安全性和臨床治療效果提供實驗依據(jù)。 方法： 捐贈的卵子用透明質(zhì)酸酶結(jié)合機

4、械吹打體視顯微鏡下去除顆粒細胞，鹽酸(pH1.5)去除透明帶，倒置顯微鏡下確認卵細胞周圍已無顆粒細胞等體細胞；之后，分別使用常規(guī)和改進的方法進行低熔點瓊脂糖包埋和亞硫酸氫鈉處理。改進的方法利用顯微鏡直視下包埋單個卵細胞，并采用1.5min沸水浴變性既保證了徹底變性又不至于造成單個細胞DNA降解。通過半巢式PCR、雙重PCR擴增H19和MEST基因片段，其中包括18個H19CpG位點和24個MESTCpG位點。利用亞硫酸氫鈉將非甲基化的胞

5、嘧啶(C)化學轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)的原理，保留PCR擴增前卵細胞DNA的甲基化信息，通過測序結(jié)果了解印跡基因H19和MEST甲基化情況。實驗分為2個部分：1、單細胞亞硫酸氫鈉測序體系的建立。2、自然周期MⅠ和MⅠⅡ卵子及超促排卵的GV、MⅠ和MⅡ卵子印跡基因H19和MEST的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 一、PCR擴增及測序 1、常規(guī)低熔點瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的PCR成功率：包埋94個卵細胞，由于操作不慎丟失3個，獲得

6、91個瓊脂小球(組A)，沸水浴變性時間均為15min以上，僅有9個PCR擴增成功，成功率為9.89％。 2、改進后的低熔點瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的PCR成功率：包埋125個卵子，共獲得125個瓊脂小球，其中28、37和60個瓊脂小球的沸水浴變性時間分別為15min或以上(組B)，2min～15min(組C)和1.5min(組D)，PCR擴增成功率分別為28.57％(8/28)、48.65％(18/37)和81.67％(49/6

7、0)。采用改進包埋方法同時1.5min沸水浴的瓊脂小球(組D)的PCR成功率最高，與其他三組比較的差異有顯著性(P＜0.01)。 3、測序：將存在條帶的41個H19和32個MEST第二輪擴增產(chǎn)物克隆測序，每個樣至少測5個克隆，結(jié)果完全符合理論預期。自然卵子H19CpG位點共18個，均為非甲基化，經(jīng)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化和PCR擴增后顯示為“TG”；MESTCpG位點共24個，均為甲基化，亞硫酸氫鈉不能將其轉(zhuǎn)化，PCR擴增后仍顯示為“CG

8、”。發(fā)現(xiàn)其中3個樣品產(chǎn)物克隆測序結(jié)果同時存在所有位點完全甲基化和完全非甲基化兩種情況，提示可能為體細胞污染所致，總污染率為6.12％(3/49)。 二、CpG位點甲基化狀態(tài) 1、自然卵子：MⅠ卵子H19完全非甲基化，MEST完全甲基化。MⅡ和MⅠ卵子完全一致。 2、超排GV卵子：所有檢測H19的11個卵子呈現(xiàn)所有位點的完全非甲基化，所有檢測MEST的6個卵子呈現(xiàn)所有位點的完全甲基化。 3、超排MⅠ卵子：檢

9、測H19的11個呈現(xiàn)所有位點的完全非甲基化，檢測MEST的9個卵子，8個為所有位點的完全甲基化，1個出現(xiàn)單個位點非甲基化。 4、超排MⅡ卵子：檢測H19的11個卵子，9個為所有位點的完全非甲基化，1個出現(xiàn)兩個CpG位點甲基化，1個出現(xiàn)單個位點甲基化，這兩個卵子的MEST基因沒有發(fā)現(xiàn)非甲基化情況。檢測.MEST的10個卵子，8個為所有位點的完全甲基化，1個出現(xiàn)兩個位點非甲基化，1個出現(xiàn)單個位點非甲基化，這兩個卵子的H19基因沒有發(fā)

10、現(xiàn)甲基化位點。這些甲基化異常的位點絕大部分位于基因表達調(diào)控的關(guān)鍵區(qū)域。 結(jié)論： 1、改進的低熔點瓊脂糖包埋后亞硫酸氫鈉測序可以檢測單細胞印跡基因的甲基化狀態(tài)，該體系穩(wěn)定可靠，PCR成功率高，體細胞污染少，結(jié)果明確。雙重PCR同時檢測同個卵子兩個印跡基因，既可以全面了解甲基化情況又減少了所需樣本數(shù)量。 2、自然MⅠ和MnⅡ卵子H19甲基化已經(jīng)完全去除，MEST甲基化已經(jīng)完成，提示印跡在MⅠ和MⅡ階段已經(jīng)建立并得以維