Akt特異性抑制劑對(duì)小鼠植入前胚合子基因組激活的影響.pdf

1、目的：
　　通過觀察Akt特異性抑制劑API-2和MK2206對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響及Akt特異性抑制劑對(duì)體外發(fā)育2-細(xì)胞胚內(nèi)Akt主要活性形式p-Ser473-Akt定位與表達(dá)的改變，結(jié)合Akt特異性抑制劑API-2對(duì)小鼠合子基因組激活（Zygotic Gene Activation,ZGA）中四個(gè)標(biāo)志基因和干細(xì)胞因子Oct4與Sox2的表達(dá)影響，為進(jìn)一步探討Akt在小鼠植入前胚發(fā)育ZGA中可能發(fā)揮的作用提供基礎(chǔ)。

2、>　　方法：
　　1.收集KM小鼠體內(nèi)植入前胚（1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚），應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-Ser473-Akt和總Akt（pan-Akt）的表達(dá)與定位情況。
　　2.收集KM雌性小鼠與KM雄性小鼠交配所得的1-細(xì)胞胚，分別觀察其在KSOM培養(yǎng)液、不同濃度的API-2和MK2206的KSOM培養(yǎng)液中體外發(fā)育的情況；
　　3.收集KM小鼠1-細(xì)胞胚，分別置于KSOM和含API-2（2μM）和MK2206（30

3、μM）的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚，采用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-Ser473-Akt和pan-Akt的定位與表達(dá)情況；
　　4.收集KM小鼠1-細(xì)胞胚，分別置于KSOM和含API-2（2μM）的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚，運(yùn)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)Hsp70.1、Zscan4d、MuERV-L和eIF-1A等ZGA標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)水平。
　　5.收集KM小鼠1細(xì)胞胚

4、，分別置于KSOM和含API-2（2μM）的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲取體外發(fā)育的2-細(xì)胞胚，運(yùn)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞因子Oct4和Sox2的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-細(xì)胞至4-細(xì)胞階段。作為Akt主要的活性形式，p-Ser473-Akt在小鼠1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚內(nèi)定位存在動(dòng)態(tài)變化，其在1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚期間核內(nèi)出現(xiàn)的時(shí)間與

5、ZGA發(fā)生的時(shí)相（minor ZGA和major ZGA）基本一致。pan-Akt主要分布在胞質(zhì)里，在不同發(fā)育階段的細(xì)胞中其表達(dá)和定位沒有發(fā)生明顯的改變；
　　2.Akt特異性抑制劑API-2和MK2206對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性。一定濃度的API-2（2.0μM）和MK2206（30μM）均可使體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚出現(xiàn)―2-細(xì)胞阻滯‖現(xiàn)象；
　　3.2.0μM API-2和30μM MK2

6、206阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi)，p-Ser473-Akt在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)發(fā)生了明顯的下調(diào)，而pan-Akt的定位與表達(dá)并沒有產(chǎn)生明顯的變化；
　　4.2.0μM API-2誘導(dǎo)阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi)，MuERV-L和eIF-1A的mRNA水平明顯低于KSOM對(duì)照組（P＜0.05），而其他基因的mRNA水平與KSOM組比較，沒有明顯差別（P＞0.05）。
　　5.2.0μM API-2誘導(dǎo)阻滯的2-細(xì)胞胚內(nèi)，干細(xì)胞因子Oct4的mRNA

7、水平明顯低于KSOM對(duì)照組（P＜0.05），而Sox2的mRNA水平與KSOM組比較，沒有明顯差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚內(nèi)定位存在動(dòng)態(tài)變化，其在1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚期間核內(nèi)出現(xiàn)的時(shí)間與ZGA發(fā)生的時(shí)相（minor ZGA和major ZGA）基本一致，提示p-Ser473-Akt可能參與ZGA過程。Akt特異性抑制劑API-2和MK2206

8、對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚的體外發(fā)育具有明顯的抑制作用，一定濃度的API-2（2.0μM）和MK2206（30μM）均可使體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚出現(xiàn)―2-細(xì)胞阻滯現(xiàn)象，同時(shí)，也使2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-Ser473-Akt表達(dá)水平下降。且一定濃度的API-2（2.0μM）使2-細(xì)胞胚內(nèi)ZGA標(biāo)志基因MuERV-L和eIF-1A，以及干細(xì)胞因子Oct4的mRNA水平明顯下調(diào)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Akt特異性抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的―2-細(xì)胞阻滯‖，以及ZGA啟動(dòng)失