水稻基因激活標簽體系的建立及初步分析.pdf

1、本研究利用T-DNA插入突變技術創(chuàng)制水稻基因激活標簽突變?nèi)后w，并對該激活標簽群體和以前創(chuàng)制的增強子捕獲群體的再生植株的T-DNA側(cè)翼序列一系列分析及激活標簽系的RT-PCR分析，探討了激活標簽載體pER38在水稻功能基因組的研究中的重要作用。 本研究是中國高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目“水稻突變體庫的創(chuàng)制與功能基因組學研究”的一部分。主要取得了以下主要研究進展： 1.通過與合作者的共同努力，建立了高效、快速的大規(guī)模

2、根癌農(nóng)桿菌介導的水稻T-DNA插入突變遺傳轉(zhuǎn)化體系，從成熟胚誘導愈傷組織開始，約90d后即可得到轉(zhuǎn)化植株。獲得潮霉素抗性愈傷組織的效率超過90％，由抗性愈傷組織分化再生植株的效率超過80％，PCR和Southern雜交檢測表明大約95％的潮霉素抗性植株含有T-DNA插入片段。提高轉(zhuǎn)化效率的關鍵在于共培養(yǎng)溫度從28-30℃降低至19～22℃，并在選擇培養(yǎng)10～15d后及時選擇繼代培養(yǎng)4～12d。利用上述程序構建了大規(guī)模的水稻基因激活標簽突

3、變體庫(約5萬份)。 2.利用PCRwalking和Tail-PCR技術對激活標簽PER38和以前創(chuàng)建的增強子捕獲標簽pFX-E24.2-15R兩個體系產(chǎn)生的再生植株T-DNA側(cè)翼序列進行分離，分別獲得172條和493條水稻水稻基因組側(cè)翼序列。通過對兩個體系的側(cè)翼序列的分離效率；T-DNA的插入位點整合模式比較分析；T-DNA插入位點的分布分析以及激活標簽系RT-PCR的分析，結果表明： (1)激活標簽載體PER38獲得

4、的再生植株獲得T-DNA的側(cè)翼序列明顯高于增強子捕獲載體pFX-E24.2-15R，比例分別為63.2％和38.1％。 (2)通過側(cè)翼序列的分析，兩個載體的T-DNA在基因區(qū)的分布相似，在基因區(qū)分布頻率較高，基因間隔區(qū)及重復區(qū)則較少；在染色體上分布與Genbank中報道的putativeexpressed和expressed的基因分布相近，而與hypotheticalgene則明顯不相關。 (3)通過激活標簽系的RT-P