抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化

1、第一章 抗生素產(chǎn)生菌的菌種及培養(yǎng),1、抗生素與產(chǎn)生菌,半數(shù)以上抗生素由放線菌產(chǎn)生；真菌與細菌。放線菌抗生素兩千多種，主要由鏈霉菌屬產(chǎn)生。,真菌抗生素,真菌抗生素有數(shù)百種，主要是點青霉和產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生的青霉素，蕁麻青霉和灰黃青霉產(chǎn)生的灰黃霉素?；尹S霉素抗真菌（皮膚病與灰指甲病），對細菌無效。青霉素抗G+菌有效，對G-菌作用很弱，對人的副作用小，有過敏反應(yīng)。,,青霉素是一類群化合物，不同青霉素的側(cè)鏈R各異。常用青霉素G，R為苯甲基。低

2、濃度抑菌，高濃度殺菌。有的細菌產(chǎn)生青霉素酶，使酰胺環(huán)開裂而失去作用。苯甲基青霉素鈉鹽0.6μg 為一個單位，1mg苯甲基青霉素鈉鹽等于1，667個單位。細菌抗生素多是多肽類化合物。如短桿菌的短桿菌素S，枯草芽孢桿菌的枯草桿菌肽，多粘芽孢桿菌的多粘菌素等，對動物有毒性，只限外用。,抗生素產(chǎn)生菌的分離和篩選,目前新抗生素的獲得途徑： 1、從自然界分離篩選新抗生素產(chǎn)生菌 從土壤到海洋 一般常見到極端微生物

3、 從微生物到植物、海洋生物。2、改造現(xiàn)有的已知抗生素的產(chǎn)生菌，再經(jīng)篩選獲得新得抗生素產(chǎn)生菌。3、從已知的抗生素進行結(jié)構(gòu)改造，經(jīng)篩選獲得新的半合成抗生素。,4、采用新的篩選方法 如：應(yīng)用定向生物合成和突變生物合成的原理，以及培養(yǎng)超敏細菌以尋找微量的抗生素，選用新的腫瘤模型來篩選抗腫瘤的抗生素。,5、采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生新抗生素（1）基因克隆產(chǎn)生新抗生素：首先獲得某已知抗生素的結(jié)構(gòu)基因，然后通過一定的

4、載體將基因片段導(dǎo)入特定的另一種抗生素產(chǎn)生菌中，則可能產(chǎn)生完全符合人們設(shè)計要求的新抗生素。 （2）沉默基因的激活： 引入抗生素生物合成的調(diào)控基因，有可能激發(fā)抗生素產(chǎn)生菌處于休眠狀態(tài)或沉默狀態(tài)的基因系統(tǒng)，從而開啟另一結(jié)構(gòu)抗生素的生物合成開關(guān)，得到新抗生素。,絕大多數(shù)抗生素的原始產(chǎn)生菌是從自然界分離篩選獲得，以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例，說明新抗生素產(chǎn)生菌的常規(guī)分離和篩選過程。,,一、土壤微生物的分離1、采土 以春、秋兩季

5、采土為宜。去除表土， 采取5-10cm深處的土壤，裝入無菌容器。2、分離菌株 將2-4克土壤均勻散布水中待其沉降，上清部分經(jīng)適當稀釋后（一般為10-3-104），涂布于適宜培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取單個菌落移種純培養(yǎng)，根據(jù)菌落的特征，初步排除相同菌。,二、篩選 ：是指從大量待篩選微生物中，盡快地鑒別出有實用價值的抗生素產(chǎn)生菌的實驗過程。,1、篩選模型： 是指篩選工作中所使用的實驗菌。為了避免感染病原菌的危

6、險，盡可能選用非致病的、且能代表某些類型致病菌的微生物作為實驗菌。,常用的實驗菌和代表的致病微生物,實驗菌 代表的致病微生物 金黃色葡萄球菌 革蘭陽性球菌 枯草芽孢桿菌 革蘭陽性桿菌 恥垢分支桿菌 結(jié)核分枝桿菌 大腸埃希菌

7、 革蘭陰性桿菌 白假絲酵母菌 酵母狀真菌 曲霉 絲狀真菌 噬菌體 病毒、腫瘤細胞,,,,2、篩選方法 抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。,先制備含實驗菌的平板，然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌的搖

8、瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。,無分支單細胞微生物的群體生長曲線,1.遲緩期（1）主要特征：代謝活躍，大量合成細胞分裂所需的酶類、ATP等；體積增大；分裂遲緩。（2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底物的酶。（3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。,2.對數(shù)期（1）特點：分

9、裂速度最快、代時最短、代謝活動旺盛、對環(huán)境變化敏感。（2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。,3.穩(wěn)定期（1）特點：新生的細胞和死亡的細胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達到最大值、代謝活力鈍化。（2）原因：營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。（3）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。,4.死亡期 特點：活的細胞數(shù)目以

10、對數(shù)速率急劇下降、細胞裂解或自溶。,1.微生物群體生長的規(guī)律,生長曲線代表在新的適應(yīng)環(huán)境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程的動態(tài)變化規(guī)律。分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期四個主要的時期。生長曲線的不同時期反映的是群體而不是單個細胞的生長規(guī)律。認識和掌握微生物的生長曲線有重要的實踐意義。如設(shè)法縮短遲緩期、延長對數(shù)期以及在穩(wěn)定期收集菌體。,絲狀微生物的群體生長1.特征：絲狀生長和沉淀生長兩種方式。2.絲狀微生物生長以單

11、位時間內(nèi)微生物的物質(zhì)量的變化來表示。,三、連續(xù)培養(yǎng),（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)1.概念： 分批培養(yǎng)：指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式。 連續(xù)培養(yǎng)：在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物(菌體和代謝產(chǎn)物)，以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持穩(wěn)定。,2.連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的類型,,第三節(jié) 環(huán)境因素對微生物生長

12、的影響,一、溫度,溫度太低：使原生質(zhì)膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進行 營養(yǎng)物質(zhì)的運輸或形成質(zhì)子梯度。 溫度太高：蛋白質(zhì)、核酸和細胞的其他組成發(fā)生不可 逆的變形作用。 最低生長溫度三種基本溫度

13、 最適生長溫度 最高生長溫度,,,根據(jù)生長溫度分類： 1. 嗜冷微生物 2.嗜溫微生物 3.嗜熱微生物 4.嗜高熱微生物,小結(jié)：,1.嗜冷微生物能夠在低溫條件下生長的原因是：其所含的酶在低溫能有效地催化生化反應(yīng)；在低溫下主動運輸仍能正常進行，有效的吸收必須的營養(yǎng)物質(zhì)

14、，是其原生質(zhì)膜中含有較多的不飽和脂肪酸，在低溫下仍可維持膜的流動性。2.嗜高溫微生物在高溫條件下生長的原因是：其酶和其他蛋白質(zhì)在高溫時更穩(wěn)定；其蛋白質(zhì)合成機構(gòu)和細胞質(zhì)膜（富含飽和脂肪酸等）等結(jié)構(gòu)成分是熱穩(wěn)定。,3.微生物耐熱性在實踐中的重要性：發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)點是發(fā)酵周期短，效率高；有利于非氣體物質(zhì)在發(fā)酵液中的擴散和溶解，以及防止雜菌的污染；可節(jié)約冷卻發(fā)酵熱量所需的成本。,二、pH,1.pH影響微生物生長的原因：介質(zhì)pH影響

15、生活環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給態(tài)和有毒物質(zhì)的毒性；影響菌體細胞膜的帶電荷性質(zhì)、膜的穩(wěn)定性及膜對物質(zhì)的吸收能力；使菌體表面蛋白變性或水解。 2.分類： 嗜酸性微生物（<pH5.4） 嗜中性微生物（pH5.4～pH8.5） 嗜堿性微生物（ pH7.0～ pH11.5）,,3.嗜酸或嗜堿微生物耐酸或耐堿的原因：主要是由于細胞本身具有維持胞內(nèi)pH值接

16、近中性的能力。嗜酸微生物在酸性環(huán)境中，細腦膜可以阻止H＋進入胞內(nèi)、不斷將胞內(nèi)H＋排出胞外。而嗜堿或耐堿微生物，則可以阻止OH－進人胞內(nèi)并將其排出胞外，以維持胞內(nèi)接近中性pH。,生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏,帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置,一、菌種的來源,根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。,二、分離思路,新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要

17、求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。,定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)

18、特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。,三、新種分離與篩選的步驟,（一）采樣,1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。,,從自然界篩選,2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3

19、、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。,培養(yǎng)基的組成原則,大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制

20、霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。,放線菌的分離,土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進

21、行系列稀釋和涂布。,次代培養(yǎng)及純化,菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。,工業(yè)菌種的

22、育種方針,工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。,工業(yè)菌種育種的方法,誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組,育種過程,包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。,選擇育種方法時綜合考慮的因素,(1)待改良

23、性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認識的明了程度； (3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。,工業(yè)菌種改良方法,(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力來提高限速酶的含量；在

24、代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。,,(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。,提高特定基因的表達水平,(1)引入強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修

25、改現(xiàn)有表達信號，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達抑制的突變。,改進菌種的生長效率,提高菌株對底物的利用率方法： a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分; b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。 c. 賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。,誘變育種,以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)

26、的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。,誘變,物理、化學(xué)或生物誘變方法,一、誘變劑和誘變處理,物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性。,化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿

27、嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。,,2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接

28、接觸就會過敏，這就更要當心。,誘變劑的選擇,1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。,,3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。,二、誘變

29、育種步驟,出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選,(一)出發(fā)菌株的選擇,1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。,5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作

30、出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。,(二)處理菌懸液的制備,這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。,(三)誘變處理,根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘

31、變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。,(四)中間培養(yǎng),由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。,,方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接

32、在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。,(五)分離和篩選,篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要

33、仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。,紫外線的誘變育種,紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。,被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個／ml。由于紫外線穿透力

34、不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。,(二)操作步驟 1．將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細

35、胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。,,3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。,4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(30

36、0ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7．挑取菌落進行篩選。,亞硝基胍誘變曲霉菌,N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。,(二)

37、操作步驟 1．單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。 2．MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。,3．誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩

38、30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計數(shù)。 4．死亡率計算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。 5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．,第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育,營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入

39、相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。,能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。,營養(yǎng)缺陷型的用途,營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。,篩選

40、營養(yǎng)缺陷型的步驟,誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜,一、誘變方法,物理誘變化學(xué)誘變,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長

41、出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。,三、檢出缺陷型,原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法、夾層法,1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標

42、記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。,(一)影印法,,4 ．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。,(二)點種法,也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)

43、果明確，但工作量大。,(三)夾層法,先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。,四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定,驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。,生長譜測定的方法,將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備

44、成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)?！獋€平皿測一個菌。,,以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。,第六節(jié) 基因育種,基因重組育種

45、：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個細胞的方法。,一個完整的基因克隆過程包括以下步驟,１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表

46、達。,2.2基因重組,一、質(zhì)粒的特點,1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于—條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。,質(zhì)粒載體,二、各類質(zhì)粒所賦予

47、宿主細胞的不同表現(xiàn)型,抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實驗室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細胞內(nèi)。,三、質(zhì)粒DNA的提取方法,細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增；細菌的收獲和裂解；質(zhì)粒DNA的提取。,四、遺傳轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同

48、源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。,(二)操作步驟：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml 2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將o.1mol／L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。,,4．當培養(yǎng)物OD600在o.5～o.8左右時，開始收獲細胞(大約需2

49、～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液。,7．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液．9．加入1ml 0.1mol／L CaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。,,11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰

50、中．加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。,常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),1、自然系統(tǒng)2、人工誘導(dǎo)（完整細胞）（1）二價陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca 2+（2）單價陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導(dǎo)（PEG/原生質(zhì)體）,重組DNA中常用的工具

51、酶,包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.,限制性內(nèi)切酶,切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點。常用限制性內(nèi)切酶種類及特性,W. Arber,H. O. Smith,限制性內(nèi)切酶的剪切方式,粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個尾，這2個尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補的，在適當條件下可以再連接一起。,其它工具酶,連接酶T4 DNA修補工具酶DNA聚合酶I末端加工酶

52、S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加polyA 或polyT 尾反轉(zhuǎn)錄酶,載體－宿主系統(tǒng),載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。,載體應(yīng)具備以下條件：,１、能在適當?shù)乃拗骷毎袕?fù)制；２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體

53、DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。,宿主細胞必須符合以下條件,１、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標準。,目的基因的獲取,一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類

54、：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA。可去除真核生物基因中不表達的內(nèi)含子。,,二、化學(xué)合成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。,PCR技術(shù),根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引

55、物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。,DNA擴增,,PCR反應(yīng),DNA片斷的克隆,載體的條件 ：,a 復(fù)制起點 b 適宜的限制酶切點c 選擇標記,DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。,一、DNA連接酶,DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段

56、相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。,重組DNA導(dǎo)入宿主菌,體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受

57、體可有不同的方法。,一、轉(zhuǎn) 化,指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。,二、轉(zhuǎn)染和感染,利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DN

58、A連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。,重組克隆的篩選與鑒定,基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。,一、抗藥性標志的篩選,如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr

59、 ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內(nèi)，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。,二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選,很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為α－肽，它表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達

60、兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。,三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；?/p>

61、重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。,重組DNA的鑒定,遺傳學(xué)方法,第七節(jié) 雜交育種,(一)細菌雜交,在細菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr

62、細胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。,（二）酵母雜交育種技術(shù),1、酵母繁殖方式 酵母為單細胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。,,單倍體細胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細胞經(jīng)其細胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細胞之間，則因細胞壁上凝集因

63、子的存在而不能進行交配。在生活過程中，酵母細胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細胞。,2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結(jié)果。,第八節(jié) 原生質(zhì)體育種,原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體

64、轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。,一、原生質(zhì)體融合育種的特點,(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的

65、細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。,(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。,二、原生質(zhì)體融合育種步驟,1．標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2．原生質(zhì)體制備。3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。

66、6．生產(chǎn)性能篩選。,三、原生質(zhì)體融合育種的要點,（一）標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。,(二)原生質(zhì)體的制備,原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原

67、細胞的一切活性。 在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。,影響原生質(zhì)體制備的因素,1．菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2．菌體的培養(yǎng)時間 為了使細胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3 ．酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨

68、不同的生長期的菌體而變化。,4．酶處理溫度 5．破壁時的pH值6．滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。,第九節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物,一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑,(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。 (2)對已知微生物的代謝產(chǎn)物進行化學(xué)修飾。 (3)