高同型半胱氨酸血癥通過(guò)線(xiàn)粒體損傷及p53依賴(lài)的凋亡途徑誘導(dǎo)ApoE---鼠心肌損傷.pdf

1、目的：觀(guān)察高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)對(duì)心肌損傷的影響,進(jìn)一步探討與心肌損傷有關(guān)的活性氧簇(ROS)、線(xiàn)粒體DNA缺失、p53蛋白及其下游凋亡蛋白(Bax、Bcl-2和Noxa)及Caspase9,Caspase3活性的變化,明確HHcy對(duì)ApoE-/-鼠心肌組織線(xiàn)粒體損傷及p53調(diào)控細(xì)胞凋亡的影響,尋找Hcy引起心肌損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn),為高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致的心血管疾病的預(yù)防和治療提供新思路和

2、理論基礎(chǔ)。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為四組,每組12只小鼠。①正常對(duì)照組:5周齡雄鼠(SPF級(jí)C57BL/6J)飼以普通飲食;②模型對(duì)照組:5周齡雄性純合子ApoE-/-鼠飼以普通飲食;③高蛋氨酸組:5周齡雄性純合子ApoE-/-鼠飼以高蛋氨酸飲食(普通飲食中加入1.7％蛋氨酸);④葉酸和維生素B12干預(yù)組:5周齡雄性純合子ApoE-/-鼠飼以高蛋氨酸飲食加0.006%葉酸和0.0004%維生素B12。喂養(yǎng)14周后,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血

3、清同型半胱氨酸和心肌酶水平;HE染色檢測(cè)心肌形態(tài);酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠活性氧簇的含量、p53、NOXA蛋白水平;試劑盒檢測(cè)caspase-9、caspase-3活性;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA的缺失、P53mRNA表達(dá);免疫組化法檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠喂養(yǎng)14周后,測(cè)定血清Hcy水平,高蛋氨酸組血清Hcy水平是正常對(duì)照組的2.5倍(P<0.01)。干預(yù)組血清Hcy水平是高蛋氨酸組的8

4、0%(P<0.01)。
　　2.各組小鼠喂養(yǎng)14周后,測(cè)定血清心肌酶譜酶活性,與正常對(duì)照組相比,高蛋氨酸組CK,LDH和HBDH分別是正常對(duì)照組的2.72(P<0.01),3.48(P<0.01)和3.12(P<0.01)倍,提示高蛋氨酸組可能導(dǎo)致了嚴(yán)重的心肌損傷。而與高蛋氨酸組相比,葉酸和VB12干預(yù)組中CK和CK-MB分別下降了55.8%,42.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.對(duì)小鼠心肌組織做HE染色觀(guān)

5、察。正常對(duì)照組心肌纖維橫紋清楚,無(wú)明顯變性、壞死現(xiàn)象,心肌間質(zhì)亦無(wú)明顯改變。模型對(duì)照組可見(jiàn)部分心肌變性,局部可見(jiàn)壞死。高蛋氨酸組可見(jiàn)心肌纖維出現(xiàn)萎縮、斷裂等病理改變。干預(yù)組心肌纖維有輕微變性,可見(jiàn)局部的胞漿均質(zhì)化,部分心肌橫紋模糊消失
　　4.ROS測(cè)定結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組和高蛋氨酸組ROS水平分別是正常對(duì)照組的1.41倍,1.73倍(P<0.01);高蛋氨酸組ROS濃度是模型對(duì)照組的1.2倍(P<0.01)。經(jīng)葉酸

6、和維生素B12干預(yù)后,ROS濃度降低,與高蛋氨酸組相比干預(yù)組ROS水平是高蛋氨酸組的70%(P<0.01)。
　　5.RT-PCR法測(cè)定各組小鼠心肌mtDNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組和高蛋氨酸組mtDNA表達(dá)量均降低,其中,模型對(duì)照組mtDNA表達(dá)量是正常對(duì)照組的63.40%(P<0.05),而高蛋氨酸組mtDNA表達(dá)是正常對(duì)照組的57.19%(P<0.05)。而與高蛋氨酸組相比干預(yù)組mtDNA的表達(dá)量是高蛋氨酸組1

7、.29倍,說(shuō)明葉酸和維生素B12可以緩解因HHcy引起的mtDNA的損傷。
　　6.測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-3活性,模型對(duì)照組、高蛋氨酸組和干預(yù)組的caspase-9活性分別是正常對(duì)照組1.26(P<0.01),1.47(P<0.01)和1.13倍(P<0.05)。模型對(duì)照組和高蛋氨酸組中caspase-3活性分別是正常對(duì)照組的1.12倍和1.50倍。
　　7.p53,Noxa表達(dá),與正常對(duì)照組比

8、較,高蛋氨酸組和模型對(duì)照組p53mRNA表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較,高蛋氨酸組和模型對(duì)照組p53蛋白表達(dá)分別是正常對(duì)照組的2.57,2.44倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí),與高蛋氨酸組比較,干預(yù)組p53mRNA和蛋白均明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。而與正常對(duì)照組相比,高蛋氨酸組Bax表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而且,高蛋氨酸組Bax/Bcl

9、-2比值是正常對(duì)照組的2.27倍,是模型對(duì)照組的2.19倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外,取各組小鼠心肌組織提取蛋白后,ELISA方法檢測(cè)NOXA蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,高蛋氨酸組NOXA表達(dá)是正常對(duì)照組的2.25倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致ApoE-/-鼠體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧,導(dǎo)致活性氧在細(xì)胞內(nèi)和線(xiàn)粒體內(nèi)聚集,造成線(xiàn)粒體和細(xì)胞的損傷;此過(guò)程激活了p53,誘發(fā)了p53依賴(lài)的