組蛋白去乙酰化酶9在高同型半胱氨酸血癥致腎臟損傷中的作用.pdf

1、研究目的:
　　高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是終末期腎病進展過程中的一個關鍵獨立致病因子，這一點已非常明確，但hHcys致腎臟損傷的病理生理學機制仍須深一步研究。
　　近年來，表觀遺傳學在腎臟疾病中的研究受到越來越多的關注，組蛋白乙酰基轉移酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)對于組蛋白賴氨酸殘基的乙?；降恼{(diào)控是其重要內(nèi)容之一。HDAC共分為四類18個亞型:Ⅰ類(Cla

2、ssⅠ)為Rpd3樣蛋白，包括HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8;Ⅱ類(ClassⅡ)為Hda1樣蛋白，又分Ⅱa類即HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9和Ⅱib類即HDAC6，HDAC10;Ⅲ類(ClassⅢ)為Ser2樣蛋白，包括SIRT1-7;Ⅳ類(ClassⅣ)為HDAC11。ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ為Zn2+依賴型，ClassⅢ為NAD+依賴型。越來越多的證據(jù)也表明HDAC可調(diào)控非組蛋白的去乙?；?。雖然，廣譜類

3、HDAC抑制劑在腫瘤治療領域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應用前景，但其缺點也非常明顯，如缺乏對HDAC亞型的特異性作用，進而引起的副作用也比較嚴重。并且，有研究發(fā)現(xiàn)HDAC參與到了腎臟纖維化進程中，雖然其所介導的腎臟纖維化機制并不十分清楚，可能與調(diào)節(jié)炎性因子、促纖維化因子的表達和激活介導腎臟纖維化信號通路有關。因此，在hHcys致腎臟損傷中，何種亞型HDAC起到作用及其機制有待明確和探討。
　　研究表明，Hippo信號通路與腎臟損傷有著密切的

4、聯(lián)系，參與腎臟纖維化等過程。為此，本課題將研究HDAC在hHcys誘導的腎臟損傷中的作用，并進一步闡明Hippo信號通路是否參與相關調(diào)控。
　　實驗方法與結果:
　　1.HDAC在hHCys模型動物腎臟中的表達
　　對C57BL/6J野生雄性小鼠（10周齡）摘除單腎，一周后隨機分為兩組，采用不含葉酸的飼料喂養(yǎng)8周來構建hHcys動物模型，喂養(yǎng)正常飼料組作為對照。高效液相色譜法檢測不含葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸含量升高，

5、證明hHcys模型構建成功。送檢尿液樣品中尿白蛋白/肌酐比值升高。過碘酸-雪夫染色方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色和透射電鏡的方法觀察足細胞損傷，結果顯示hHcys小鼠腎臟中出現(xiàn)明顯的系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，足突融合，表明腎小球存在損傷;Masson染色方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色，hHcys模型腎臟中出現(xiàn)纖維化病變，提示腎臟功能障礙，腎小管出現(xiàn)損傷。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，11個HDAC亞型中HDAC9表達升高最為明顯。通過蛋白

6、免疫印跡免疫組織化學染色、免疫熒光雙重標記檢測HDAC9在腎臟中表達變化和分布，相比其他部分Zn2+依賴型HDAC，HDAC9在hHcys模型小鼠腎臟皮質(zhì)中表達上調(diào)最為明顯，在足細胞、遠曲小管和集合管中均表達升高。通過L型同型半胱氨酸刺激足細胞和腎小管上皮細胞，結果顯示HDCA9呈現(xiàn)劑量依賴性升高。
　　2.HDAC9在hHcys致腎臟損傷中的作用及機制
　　HDAC9基因沉默大鼠模型構建采用大鼠腎臟局部注射重組的包備有sh

7、RNA-HDAC9的慢病毒載體pGLV3/H1/GFPtPuro(pGLV3)介導大鼠腎臟HDAC9基因沉默，二十只SD雄性大鼠隨機平均分為四組，構建hHcys動物模型。IF實驗結果顯示，慢病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)廣泛表達，并且與足細胞標志物synaptopodin和集合管標志物AQP3共定位。進行Masson染色分析，結果顯示，HDCA9沉默減輕高同型半胱氨酸血癥誘導的腎臟纖維化。PAS染色結果說明，腎小球基底膜的增厚和系膜增

8、生能一定程度上被HDAC9沉默所緩解。體內(nèi)實驗IF、IHC和體外實驗WB結果顯示由hHcys所介導的足細胞裂孔隔膜相關蛋白nephrin表達下調(diào)和正常結構形態(tài)的破壞能夠一定程度上被HDAC9的沉默所逆轉，并且纖維連接蛋白fibronectin這一促纖維化因子在hHcys介導下的高表達能夠一定程度上被HDAC9的沉默所抑制。
　　hHcys模型大鼠腎臟中，Hippo核心蛋白YAP表達上調(diào)，可被HDAC9沉默所抑制。體外實驗中，L-H

9、cys能夠誘導HK-2細胞中YAP的表達上調(diào)，基因沉默HDA9可以阻斷YAP對Hcys的應答，并且下游Smad2、Smad3的活性也被抑制，表明HDAC9可能通過YAP-Smad2/3信號通路來促進hHcys誘導的腎臟損傷。
　　結論與創(chuàng)新性:
　　1.本研究次發(fā)現(xiàn)HDAC9在hHcys模型小鼠和大鼠腎臟中顯著升高，并且在HK-2和HPC細胞中，HDAC9呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴性升高?；虺聊琀DAC9減輕了hHcys介導的