普萘洛爾治療血管瘤作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：血管瘤是嬰幼兒時(shí)期最常見的良性腫瘤，新生兒的發(fā)病率為10～12％，系真性血管腫瘤，以血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖和血管異常生成為特點(diǎn)。好發(fā)于頭、面、頸部，其次為四肢和軀干。女嬰較男嬰為多，比率為2～5∶1。Mulliken根據(jù)血管瘤組織學(xué)特點(diǎn)將其病程分為三個(gè)時(shí)期:增生期、消退期和消退完全期。增生期的特點(diǎn)是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速分裂增殖、大量堆積，基底膜增厚分層，肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞等聚集。在消退期，內(nèi)皮細(xì)胞的更新減慢，細(xì)胞實(shí)質(zhì)逐漸被纖

2、維脂肪組織所代替。在消退完成期，纖維脂肪組織進(jìn)一步在血管內(nèi)沉積。85-90％的嬰幼兒血管瘤可自行消退，這是血管瘤與其他良性腫瘤的最大區(qū)別。但消退過程漫長，一般可持續(xù)至約10歲，消退過程中因其生長部位、體積及腫塊的生長速度等不同常影響患兒容貌、功能及心理，且大多數(shù)遺留各種畸形，如位于氣道的瘤體常壓迫氣管而導(dǎo)致患兒呼吸困難;少數(shù)瘤體體積過大的血管瘤可導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的異常，引起患兒心功能不全而危及生命;生長速度過快的血管瘤往往出現(xiàn)皮膚破潰、出

3、血并引起明顯的疼痛，影響患兒生長發(fā)育。因此，對(duì)于嬰幼兒血管瘤需采取積極的治療措施。目前治療方法多種多樣，嬰幼兒血管瘤的主要治療方法包括了糖皮質(zhì)激素、激光、同位素、冷凍療法、干擾素、手術(shù)治療等等。這些方法均有一定的療效，也有不同程度的并發(fā)癥，從而限制他們?cè)谂R床上的應(yīng)用。2008年，法國Bordeaux兒童醫(yī)院的Léauté— Labrèze在使用普萘洛爾治療1例伴肥厚性梗阻性心肌病的血管瘤患兒和1例伴心輸出量增加的血管瘤患兒時(shí)，意外地發(fā)現(xiàn)

4、血管瘤體積萎縮變小，表面皮膚張力變小，質(zhì)地變軟，顏色變淺。之后在征得患兒父母同意的前提下，他們對(duì)其他9例頜面部血管瘤患兒同樣采用口服普萘洛爾治療，所有患兒用藥24小時(shí)后均出現(xiàn)了血管瘤顏色變淺，質(zhì)地變軟，之后瘤體范圍也出現(xiàn)不同程度的縮小。該研究成果發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)》上，這種新治療方法開創(chuàng)了普萘洛爾治療血管瘤的先河，報(bào)道引起了許多國內(nèi)、外學(xué)者的關(guān)注，其后，又有許多專家、學(xué)者相繼報(bào)道了應(yīng)用此方法治療嬰幼兒血管瘤，均取得較好療效。普萘洛爾治

5、療嬰幼兒血管瘤的療效確切、患兒痛苦小、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)得到了專家學(xué)者的認(rèn)可，在臨床上的運(yùn)用越來越廣泛。 普萘洛爾是非選擇性腎上腺素β-受體阻滯劑，能競爭性拮抗神經(jīng)遞質(zhì)和兒茶酚胺對(duì)β-受體的激動(dòng)作用。普萘洛爾通常在心內(nèi)科用于治療高血壓、室上性心動(dòng)過速、缺血性心臟病、心律失常等疾病，而在兒科用于治療心臟疾病或者新生兒甲狀腺功能亢進(jìn)。普萘洛爾已經(jīng)在臨床上運(yùn)用了40多年，長時(shí)間的臨床使用證實(shí)了其安全性、耐受性良好。但是普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的作

6、用機(jī)制至今還不甚明了。科研工作者及臨床醫(yī)生們?cè)噲D找出普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤具體作用機(jī)制，但臨床上嬰幼兒隨訪性較差，又缺乏合適的動(dòng)物模型，無法運(yùn)用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行跟蹤。我們建立動(dòng)物模型，利用實(shí)驗(yàn)方法探索普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的可能作用機(jī)制，并通過了解嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制研究普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的作用機(jī)制，以便臨床上更好的治療嬰幼兒血管瘤，減少并發(fā)癥發(fā)生。
　　 方法：⑴人體血管瘤組織來源于一例2個(gè)月男性患兒，為右頸部皮膚及皮

7、下血管瘤，家屬訴近期生長迅速，面積約2.3cm×2.1cm，未經(jīng)任何治療。在無菌條件下手術(shù)切除人體血管瘤標(biāo)本，部分送病理及免疫組化染色，剩余部分去除脂肪纖維組織立即置入0-4℃細(xì)胞培養(yǎng)液中保存，送至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。超凈工作臺(tái)，將血管瘤組織塊切成3mm×4mm×5mm小塊，備用。BALB/nu/nu裸小鼠10只，鼠齡5-6周，雌雄不限，體重20g左右。2.5％戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉裸小鼠，裸鼠麻醉起效后，經(jīng)皮膚切口將血管瘤組織

8、置于頸背部皮下，每只4處，無需縫合，手術(shù)需1小時(shí)內(nèi)完成。動(dòng)物模型建立后任其自然生長，分別于14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑a及橫徑b，根據(jù)公式V=π/6ab2估算腫瘤體積變化。于第30天、60天各取4個(gè)標(biāo)本，做蘇木精-伊紅染色(HE)、CD31、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)染色，觀察各項(xiàng)指標(biāo)。⑵收集廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院全軍激光整形中心自2010年10月至2012年09月門診及住院的口服普萘

9、洛爾治療的嬰幼兒血管瘤患幾共10例。男性4例，女性6例，年齡為52天～10個(gè)月，平均年齡4.5個(gè)月。體重5.1～8.6kg，平均7.9kg其中頭面部6例、頸部2例、四肢1例、背部1例。瘤體面積:最大5cm×4cm、最小1.0cm×0.6cm?；純壕床扇∵^任何其他治療手段，且健康狀況良好，無遺傳病、傳染病等病史。分別在患兒口服前、服藥后1個(gè)月、服藥后3個(gè)月及服藥后半年的時(shí)間點(diǎn)用直徑為2mm的皮膚環(huán)鉆取得血管瘤瘤體組織標(biāo)本，當(dāng)即用甲醛固定

10、后常規(guī)石蠟包埋保存。將標(biāo)本相應(yīng)分為服藥前組、服藥后1個(gè)月、服藥后3個(gè)月及服藥后半年組。⑶將各組織塊常規(guī)切片后行HE染色及石蠟切片免疫組織化學(xué)法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，S-P法）染色。切片時(shí)注意縱切組織塊以確保能在顯微鏡下觀察到由表皮至皮下血管瘤組織各層組織。HE染色后的組織切片可以觀察組織的基本結(jié)構(gòu)。各個(gè)標(biāo)本都檢測(cè)CD31、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)的表達(dá)。其中CD31是常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物

11、，通過檢測(cè)CD31以觀察血管瘤瘤體組織中的血管密度。每張切片在高倍鏡下(20×10、40×10)觀察。⑷組織切片染色后顯微鏡（為Olympus公司生產(chǎn)型號(hào)為BX-51的正置熒光顯微鏡）下觀察結(jié)果，并且運(yùn)用電腦數(shù)字軟件(Image-pro plus.Version6.3.1.542)捕捉標(biāo)記了VEGF、VEGFR、CD31的組織切片圖像及測(cè)量積分光密度值。
　　 結(jié)果：①人體血管瘤組織標(biāo)本送病理檢查結(jié)果符合血管瘤病理變化，CD31

12、、GLUT1染色結(jié)果均為強(qiáng)陽性。血管瘤組織標(biāo)本植入裸鼠皮下7-10天傷口逐漸愈合，但由于切口未縫合，部分組織塊移位，暴露于切口處。10-20天組織塊無明顯變化，21天開始逐漸縮小，60天時(shí)裸鼠頸背部皮膚表面平坦，已觀察不到組織塊，但可觸及。于第30天及60天切取標(biāo)本進(jìn)行HE染色，表現(xiàn)為移植血管瘤纖維化病理特點(diǎn)，血管瘤并未生長，CD31、Glutl染色結(jié)果陰性，動(dòng)物模型建立失敗。②普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤臨床觀察，口服普萘洛爾半年后，患兒

13、血管瘤體積縮小，顏色變淡，治療效果明顯。治療期間，有一例患兒出現(xiàn)輕微腹瀉，未給予任何干預(yù)治療2天后患兒自行好轉(zhuǎn)。HE染色可見從表皮至皮下的血管瘤瘤體組織等全層結(jié)構(gòu)及瘤體變化過程，顯示瘤體逐漸萎縮變小。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示CD31標(biāo)記表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上，可觀察血管密度，服藥前與服藥后一個(gè)月、三個(gè)月、半年血管密度逐漸減小，差異明顯。即血管瘤瘤體組織內(nèi)的微血管密度逐漸下降。服藥前嬰幼兒血管瘤瘤體中的VEGF、VEGFR表達(dá)強(qiáng)度與服

14、藥后一個(gè)月、三個(gè)月、半年的表達(dá)強(qiáng)度相比，有顯著性差異，服藥后VEGF、VEGFR表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間延長而逐漸降低。服藥三個(gè)月與半年之間無明顯差異。
　　 結(jié)論：⑴建立嬰幼兒血管瘤動(dòng)物模型必需具備適宜的供體、受體，選取多部位種植，并根據(jù)多年來對(duì)血管瘤的認(rèn)識(shí)，建立其適宜生長的條件，如雌激素。⑵普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的主要作用機(jī)制通過降低VEGF及其受體的表達(dá)，抑制血管生長，減少新生血管的生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使血管瘤縮小，達(dá)到治