USP22對膠質母細胞瘤生物學特性的調節(jié)作用研究.pdf

1、研究背景
　　 多形性膠質母細胞瘤(GBM)起源于星形細胞或星形膠質祖細胞，是成人常見的中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤，在WHO顱內腫瘤分類中屬星形細胞腫瘤Ⅳ級。因其具有高增殖和侵襲性行為，病情進展迅速，預后差。結合藥物化療和放射治療的手術治療是經典的治療方法，然而化療的毒性反應、耐藥問題以及放療副反應大，均導致目前多形性膠質母細胞瘤治療手段上尚無突破性進展。
　　 在多形性膠質母細胞瘤的發(fā)生過程中，涉及到許多基因水平的改變，如癌

2、基因的激活和放大，生長因子和(或)其受體的活化等。近年來，有學者針對膠質瘤的代謝、信號轉導和細胞通路上的重要靶點進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)：原發(fā)性GBM患者常有內皮生長因子受體(EGFR)的擴增和突變、染色體10q雜合性缺失、抑癌基因PTEN變異和P16的缺失等。針對惡性膠質瘤癌基因的活化、細胞增殖、凋亡、血管生成或遷移相關的蛋白質的過度表達，許多學者采用了不同的靶向治療方案，并取得了一些進展，顯示了基因靶向治療具有良好的應用前景。

3、>　　 USP22基因是近年發(fā)現(xiàn)的BMI-1通路上11個標記基因中的一個，在人體各組織中均有表達，表達量不等，其編碼的蛋白質屬于具有泛素特異性修飾酶家族。已有研究表明，BMI-1信號轉導通路上的包括USP22在內的11個基因具有干細胞樣表達模式，在正常干細胞和部分高度惡性腫瘤細胞中均有表達，與腫瘤的短期內復發(fā)、遠處轉移和治療耐受密切相關，符合這種轉錄模式的癌癥患者在腫瘤早期就表現(xiàn)出高度惡性的臨床行為。USP22作為能夠早期判斷病情和預

4、測療效的腫瘤干細胞標記基因之一，其作用逐漸被認識。近年來的研究讓我們有理由推測USP22高表達可能是膠質母細胞瘤錯綜復雜的轉錄調控途徑中的關鍵點之一，也是潛在的治療靶點。
　　 研究方法
　　 第一部分：通過RT-PCR和westernblot技術檢測USP22在正常腦組織和膠質母細胞瘤中的表達。
　　 第二部分：將病理證實為多形性膠質母細胞瘤的組織使用酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)；設計并合成三對siRNA，分別轉染

5、原代培養(yǎng)細胞，通過RT-PCR和westernblot技術檢測siRNA干擾后USP22的表達，篩選出干擾效果最佳的一對；用篩選出的siRNA轉染原代培養(yǎng)GBM細胞，利用MTT試驗，驗證RNA干擾對原代培養(yǎng)細胞活性的影響；進而用流式細胞儀檢測USP22-specificsiRNA對細胞周期的影響，并用AnnexinV-FITC和PI雙染色檢測細胞凋亡情況；初步探索參與GBM細胞周期調控的信號通路。
　　 結果
　　 1.

6、對GBM患者腫瘤組織以及正常腦組織進行比較，采用westernblot和RT-PCR檢測USP22表達水平。結果顯示GBM組織中USP22表達水平較正常對照組明顯增高。
　　 2.原代培養(yǎng)的GBM細胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，狀態(tài)良好，免疫熒光顯示細胞內GFAP高表達。
　　 3.設計合成的三對USP22-specificsiRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)分別轉染原代細胞后，

7、細胞中USP22表達均下降，其中siRNA-3干擾效果明顯。使用篩選出的siRNA-3轉染原代培養(yǎng)膠質母細胞瘤細胞，設置轉染control-siRNA的細胞為陰性對照組，MTT法檢測細胞活性，結果表明在轉染USP22-specificsiRNA后，腫瘤細胞的增殖被明顯抑制，48小時、72小時和96小時三個時間點對應的細胞存活率分別為(65.1±4.3)％，(53.5±5.2)％和(47.2±4.3)％。而陰性對照組轉染controlsi

8、RNA后對腫瘤細胞的增殖沒有明顯的抑制作用。從48小時起，兩組的細胞活性存在明顯差異。
　　 4.轉染USP22-specificsiRNA不能明顯增加GBM早期凋亡，提示在GBM中USP22通路可能不是調控其凋亡能力的主要信號通路。
　　 5.USP22-specificsiRNA作用48小時可以明顯增加G0/G1期細胞比例，這提示USP22-specificsiRNA主要通過誘導G1/S期的周期阻滯和增加細胞死亡來減

9、少GBM增殖。
　　 6.體外實驗中轉染USP22-specificsiRNA后，p53、p21和cyclinE的表達水平較對照組未發(fā)生改變，參與GBM細胞周期調控的信號通路復雜，具體機制有待進一步研究。
　　 結論
　　 1.膠質母細胞瘤組織中USP22表達在蛋白水平和mRNA水平均較正常腦組織明顯增高。
　　 2.使用酶消化法可獲得生長良好的原代培養(yǎng)膠質母細胞瘤細胞，細胞免疫熒光GFPA陽性。