中國水仙花型、花色發(fā)育基因(NTMADS1、NtMADS3、NTPDS1和NTPZDS1)的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、中國水仙（Narcissus tazetta var．chinensis）是世界著名的球根花卉，也是我國傳統(tǒng)名花中出口創(chuàng)匯的重要種類。由于中國水仙是同源三倍體，利用傳統(tǒng)的雜交和實(shí)生選種方法產(chǎn)生新品種存在極大困難，加之野生資源高度匱乏，致使中國水仙品種單一成為我國水仙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。克隆與中國水仙花型和花色發(fā)育相關(guān)的功能基因，建立優(yōu)化的中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅可以在一定程度上揭示中國水仙花型和花色的變異機(jī)理，還可為利用植物基因工程改

2、良中國水仙的觀賞性狀提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究對中國水仙的兩個MADS-box基因（NTMADS1和NtMADS3）、兩個花色發(fā)育基因（NTPDS1和NTZDS1）和遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，主要結(jié)論如下：
　　1、利用RT-PCR技術(shù)，從中國水仙‘玉玲瓏’幼嫩花序中克隆到NTMADS1基因，序列分析表明，NTMADS1 cDNA片段總長為879 bp，含有完整的開放閱讀框架，編碼230個氨基酸。與擬南芥MADS-box基因家族

3、的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因?qū)儆贏G亞族的C類功能基因。利用RT-PCR方法，研究了NTMADS1基因在開花期的組織特異表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)NTMADS1基因只在中國水仙花中表達(dá)，且豐度極高；在花的雄蕊中表達(dá)量最高，其次為副冠、雌蕊，在花瓣中幾乎未檢測到該基因表達(dá)。以pBI121為載體，構(gòu)建了該基因的正義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法和蘸花法，將構(gòu)建好的基因分別在煙草和擬南芥中異位表達(dá)。通過對轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)NTMADS1基因的

4、擬南芥植株開花期明顯早于野生型，且花型出現(xiàn)顯著變化，如雄蕊心皮狀、花瓣全部或部分退化、頂部莖生葉出現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)等。轉(zhuǎn)基因煙草則出現(xiàn)花冠裂片變短且邊緣不規(guī)則、花筒開裂、花藥退化等現(xiàn)象。初步表明NTMADS1參與了花型和花期的調(diào)控。
　　2、利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從中國水仙‘金盞銀臺’幼嫩花序中克隆到NtMADS3基因，序列分析表明，NtMADS3 cDNA總長為980 bp，含有一個726 bp的完整ORF，編碼241個氨基

5、酸。與擬南芥MADS-box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因與擬南芥(A. thaliana)的AGL6親緣關(guān)系最近，屬于E類功能基因。利用RT-PCR方法分析了該基因在開花期的組織特異表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn) NtMADS3基因在中國水仙開花期的花、葉片、鱗片和根系中以及花的各個部位均有表達(dá)。將構(gòu)建在pBI121載體上的NtMADS3基因在煙草和擬南芥中異位表達(dá)，通過對轉(zhuǎn)基因植株表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn) NtMADS3基因擬南芥植株開花期明顯早于野

6、生型，但花型未出現(xiàn)顯著變化；部分轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)植株矮小和蓮座葉卷曲現(xiàn)象，但絕大部分表現(xiàn)正常。轉(zhuǎn)基因煙草則出現(xiàn)花筒開裂、雄蕊退化或瓣化等現(xiàn)象。初步表明NtMADS3基因參與了花期和花型的調(diào)控。
　　3、從中國水仙‘金盞銀臺’幼齡花序中克隆到中國水仙八氫番茄紅素脫氫酶（NTPDS1）基因和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（NTZDS1）基因。序列分析表明，NTPDS1 cDNA片段總長為1719 bp，含有完整的開放閱讀框架，可編碼含570個氨基酸

7、；NTZDS1基因總長為1899 bp，ORF可編碼574個氨基酸。兩個基因均在中國水仙的花中大量表達(dá)，且在花瓣和副冠中的表達(dá)量高于雄蕊和雌蕊；葉片和根中的表達(dá)量次之；在鱗片中表達(dá)量極少或檢測不到表達(dá)。構(gòu)建了兩個基因的pBI121和pCAMBIA1300植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌將上述基因轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中，得到了卡那抗性的再生植株。
　　4、以中國水仙不同部位外植體進(jìn)行了不定芽直接分化和愈傷組織誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，結(jié)果表明，雙鱗片外植

8、體在MS0＋6-BA10.0 mg/L＋NAA1.0 mg/L＋蔗糖40 g/L＋瓊脂7.5 g/L培養(yǎng)基上可以大量地直接再生，再生芽數(shù)量平均可達(dá)13～16個/cm雙鱗片，比傳統(tǒng)的鱗莖盤之間分化提高30~50％；鱗片、葉片、花葶及花部不同組織在適宜的配方中均可不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，但以帶花藥的花絲誘導(dǎo)出的愈傷組織最好。篩選抗生素和抑菌抗生素濃度試驗(yàn)表明，花絲產(chǎn)生的愈傷組織的選擇壓為潮霉素15~20 mg/L；羧芐青霉素的抑菌濃度為2