漳州水仙開花及花色基因植物表達載體構建與轉化研究.pdf

1、中國水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)屬石蒜科水仙屬，屬于法國多花水仙的變種，主要生產在上海、浙江、福建等地，其中以漳州水仙最有名，是、一類觀賞價值非常高的經濟植物。三倍體的中國水仙，難以自然育種或是通過人工雜交產生新的品種。品種單一、繁殖速度有限、病毒積累導致品質下降和品種退化等問題已大大阻礙了中國水仙的發(fā)展。因此，開展開中國水仙新品種培育和品種改良的工作意義重大。隨著分子生物學的崛起和植物基因工程

2、等技術的發(fā)展，為中國水仙新品種的培育提供了新的方法。本研究以漳州水仙為材料，克隆出開花時間調節(jié)基因 AP1、FT，并構建了植物表達載體 pCAMBIA1301-NtFT、pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtFT-OCS和pC2300-35S-NtAP1-OCS，以農桿菌為介導轉化煙草和漳州水仙，獲得了31株的轉基因煙草和3株抗性水仙幼苗。同時克隆出花色形成類黃酮代謝途徑中關鍵基因FLS和ANS，構建了植物表達載

3、體pC2300-35S-NtANS-OCS、pBI121-FLS RNAi，并分別注射到水仙花瓣和副冠中進行瞬時表達，觀察到水仙花瓣和副冠顏色均發(fā)生了變化。研究結果將為開發(fā)中國水仙早花新品種和改良花色提供技術基礎和理論參考。
　　主要研究內容及結果如下：
　　1、提取漳州水仙花蕾和葉片的RNA，逆轉錄成cDNA，并以此為模板，根據已發(fā)表的水仙的FT、AP1、FLS、ANS基因的全長序列設計特異性引物，利用常規(guī)PCR技術分別克

4、隆出中國水仙中控制開花時間的關鍵基因FT、AP1和類黃酮途徑中關鍵基因FLS、ANS。分別構建了植物表達載體pCAMBIA1301-NtFT、pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtANS-OCS、pC2300-35S-NtFT-OCS、pC2300-35S-NtAP1-OCS和pBI121-FLSRNAi。農桿菌介導構建好的pC2300-35S-NtFT-OCS和pC2300-35S-NtAP1-OCS載體轉化到

5、煙草中，pCAMBIA1301-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1載體轉化到漳州水仙中。
　　2、以農桿菌介導的NtAP1和NtFT載體轉化煙草，獲得了轉基因煙草植株，用PCR和Real-time quantitative PCR進行了檢測，證明所獲得植株為轉基因植株。發(fā)現(xiàn)轉基因煙草植株的花期均比非轉基因的要提前10天左右，在表型上發(fā)現(xiàn)轉基因植株均比非轉基因植株瘦弱矮小。
　　3.以農桿菌介導pCAMBIA1301

6、-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1載體轉化了漳州水仙，初步獲得了3株抗性幼苗。
　　4.首先用GUS基因建立漳州水仙花瓣和副冠中農桿菌介導瞬時表達技術體系，結果表明此方法可以應用在水仙花瓣和副冠中。將構建好的pC2300-35S-NtANS-OCS、pBl121-NtFLSRNAi和pSAK277-MdMYB10（本實驗室保存）載體以農桿菌介導導入漳州水仙的花瓣和副冠中進行瞬時表達，初步觀察到水仙花瓣和副冠中顏色發(fā)生了