兩種常用季銨鹽型抗菌單體抗菌性能、細(xì)胞毒性的比較研究及其細(xì)胞毒性機(jī)理初探.pdf

1、基于對(duì)細(xì)菌在齲病這一感染性疾病中關(guān)鍵作用的深入理解，近年來(lái)許多學(xué)者都致力于研發(fā)新型具有抗菌性能的功能性齒科材料。以往通過直接添加可溶性有機(jī)抗菌劑或無(wú)機(jī)抗菌劑對(duì)齒科材料進(jìn)行抗菌改性的方法因抗菌劑的突釋效應(yīng)及對(duì)材料本身機(jī)械性能的不利影響已逐漸被學(xué)者們拋棄。
　　“可聚合抗菌劑”是一種具有聚合功能的抗菌劑，其能夠通過共價(jià)鍵將抗菌功能基團(tuán)穩(wěn)固交聯(lián)結(jié)合于基質(zhì)材料，從而賦予基質(zhì)材料不依賴活性成分釋放的、穩(wěn)定的接觸抑菌功能，是研發(fā)新型抗菌齒科修

2、復(fù)材料的新策略。日本的Imazato教授在國(guó)際上最先合成可用于齒科樹脂基材料的可聚合抗菌劑甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶（methacryloyloxydodecylpyridiniumbromide，MDPB）單體，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出目前國(guó)際上唯一商品化的抗菌粘接系統(tǒng)。近年來(lái)，本人所在課題組在國(guó)內(nèi)率先開展了可聚合抗菌劑的研究，合成了與MDPB結(jié)構(gòu)類似的多種抗菌單體。這些抗菌單體均依賴其分子結(jié)構(gòu)中的季銨基團(tuán)發(fā)揮抗菌作用，因此被統(tǒng)稱為季銨鹽型

3、抗菌單體。本課題組通過前期性能檢測(cè)優(yōu)選出甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶（methacryloxylethylcetyldimethylammoniumbromide，DMAE-CB）進(jìn)行齒科樹脂基材料抗菌改性研究，并證實(shí)將DMAE-CB添加到粘接劑或窩溝封閉劑中可以在不顯著影響材料本身理化性能的同時(shí)賦予其穩(wěn)定的抑菌功能。但是，基于抗菌單體的功能性齒科材料在臨床上的成功應(yīng)用不僅依賴于其良好的抗菌性能和理化性能，還在很大程度上取決于其生物安全性

4、能。因此研究季銨鹽型抗菌單體的細(xì)胞毒性及其引起細(xì)胞毒性的機(jī)理、并探索可能的保護(hù)措施具有重要的意義。但是目前尚無(wú)這方面的研究。
　　1.研究目的
　　本研究首先以MDPB和DMAE-CB為代表，比較不同結(jié)構(gòu)的季銨鹽單體抗菌性能、細(xì)胞毒性的差異，并在此基礎(chǔ)上探索其細(xì)胞毒性的機(jī)制并尋找可能的降低其細(xì)胞毒性的措施，為日后改善抗菌齒科樹脂基材料的生物安全性、拓展其在深齲及牙髓保護(hù)方面的應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)支持。
　　2.主要研究方

5、法：
　　2.1.通過最小抑菌濃度（Minimalinhibitoryconcentration，MIC）測(cè)試、最小殺菌濃度（Minimalbactericidalconcentraion，MBC）測(cè)試、快速殺菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)并比較兩種季銨鹽型抗菌單體DMAE-CB與MDPB的抗菌效應(yīng)，并研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）對(duì)上述單體抗菌性能的可能影響。
　　2.2.采用死菌/活菌熒光染色

6、和激光共聚焦顯微鏡觀察比較DMAE-CB和MDPB對(duì)黏附狀態(tài)細(xì)菌的快速殺滅作用。
　　2.3.采用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5二苯基四氮唑溴鹽法（MTT法）評(píng)價(jià)DMAE-CB與MDPB對(duì)細(xì)胞增殖及存活情況的影響，并研究抗氧化劑NAC和納米鉑凝膠顆粒（Colloidalplatinumnanoparticles，CPtN）對(duì)抗菌單體細(xì)胞毒性的可能影響。
　　2.4.通過檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（Alkalinepho

7、sphatase，ALP）的活性，評(píng)價(jià)DMAE-CB與MDPB對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響，并探索NAC對(duì)上述單體引起的分化抑制的可能影響。
　　2.5.通過ALP-馮庫(kù)薩染色檢測(cè)兩種季銨鹽型抗菌單體DMAE-CB與MDPB對(duì)成骨細(xì)胞礦化功能的影響。
　　2.6.采用熒光染色和流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，評(píng)價(jià)季銨鹽型抗菌單體對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞凋亡和壞死的影響，探索細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及線粒體依賴性凋亡通路是否與抗菌單體的細(xì)胞毒性作用有

8、關(guān)。
　　2.7.通過westernblot技術(shù)，探索銨鹽型抗菌對(duì)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax及細(xì)胞色素C等線粒體依賴性凋亡通路的相關(guān)分子的表達(dá)及分布的影響，明確線粒體依賴性凋亡通路在抗菌單體引起的細(xì)胞死亡中的作用。
　　3.主要研究結(jié)果
　　3.1.DMAE-CB的MIC（3.91-7.81μg/mL）和MBC（7.81μg/mL）值低于MDPB（MIC：7.81-31.3μg/mL；MBC：125-250μg/mL），

9、提示DMAE-CB抗菌性能強(qiáng)于MDPB。
　　3.2.季銨鹽型抗菌單體對(duì)游離及黏附狀態(tài)下的變形鏈球菌均具有快速殺滅作用，且DMAE-CB的作用強(qiáng)于MDPB。
　　3.3.季銨鹽型抗菌單體對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和存活具有抑制作用，DMAE-CB的抑制作用強(qiáng)于MDPB，但與常用牙科單體Bis-GMA的抑制作用相當(dāng)。
　　3.4.季銨鹽型抗菌單體對(duì)成骨細(xì)胞的分化具有抑制作用，且較低濃度的上述抗菌單體即可引起細(xì)胞分化的顯著抑制。

10、r>　　3.5.季銨鹽型抗菌單體對(duì)成骨細(xì)胞的礦化功能具有抑制作用，可顯著減少鈣沉淀的形成。
　　3.6.季銨鹽型抗菌單體可引起小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的紊亂，并使其通過凋亡和壞死兩種方式發(fā)生死亡。
　　3.7.季銨鹽型抗菌單體可引起小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）水平呈時(shí)間及濃度依賴性上升。
　　3.8.季銨鹽型抗菌單體可引起小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的喪失、下調(diào)抑凋亡分子B

11、cl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡分子Bax的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，提示抗菌單體激活了線粒體依賴性凋亡通路。
　　3.9.抗氧化劑NAC對(duì)季銨鹽型抗菌單體的細(xì)胞毒性具有一定的緩解作用，但抗氧化劑CPtN卻增強(qiáng)了其毒性。
　　3.10.抗氧化劑NAC對(duì)季銨鹽型抗菌單體引起的成骨細(xì)胞分化的抑制沒有顯著影響。
　　3.11.抗氧化劑NAC在可降低細(xì)胞毒性的濃度（10mM）下對(duì)DMAE-CB和MDPB的快速殺菌活

12、性沒有顯著不利影響。
　　4.主要結(jié)論
　　4.1.季銨鹽型抗菌單體對(duì)游離及黏附狀態(tài)下的細(xì)菌均有快速殺菌作用，且DMAE-CB的抗菌性能強(qiáng)于MDPB。
　　4.2.季銨鹽型抗菌單體對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化有不利影響，且DMAE-CB的毒性稍大于MDPB，但DMAE-CB對(duì)細(xì)胞增殖的影響與常用交聯(lián)單體Bis-GMA相當(dāng)。
　　4.3.季銨鹽型抗菌單體的細(xì)胞毒性與ROS過量產(chǎn)生有一定關(guān)系，并可以導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂

13、、凋亡及壞死的發(fā)生。
　　4.4.季銨鹽型抗菌單體可以激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，并導(dǎo)致部分細(xì)胞通過凋亡模式發(fā)生死亡。
　　4.5.抗氧化劑NAC對(duì)季銨鹽型抗菌單體引起的細(xì)胞死亡具有一定的緩解作用，卻對(duì)其引起的細(xì)胞分化抑制作用無(wú)顯著影響。另一種抗氧化劑CPtN會(huì)增強(qiáng)季銨鹽型抗菌單體的細(xì)胞毒性。
　　4.6.抗氧化劑NAC在可降低細(xì)胞毒性的濃度（10mM）下對(duì)季銨鹽型抗菌單體的快速殺菌作用沒有不利影響。
　　綜上所述