基于基因表達芯片技術(shù)的鎳離子細胞毒性機理研究.pdf

1、金屬生物醫(yī)學材料鎳鈦合金，由于具有良好的力學、物理、化學性能，以及形狀記憶的智能特性，在人體矯形、介入性治療、牙科、面部治療等醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是，鎳鈦合金中約含有56wt％的鎳元素，其在體內(nèi)釋出的鎳離子對生物體潛在的危險沒有排除。為了使鎳鈦合金材料在生物體內(nèi)的使用更加安全可靠，需要對鎳離子的生物相容性進行長期深入的研究。 本論文的研究目的之一是在細胞毒性實驗的基礎(chǔ)上，采用基因表達芯片技術(shù)和生物信息學以及RT-PCR驗

2、證的研究方法，從基因組水平上探索Ni<'2+>離子對細胞的分子毒性機理，評價其分子生物相容性。研究目的之二是探索研究生物材料與機體相互作用的機理的新途徑，為建立基于基因表達芯片技術(shù)的生物材料相容性評價的新方法打下基礎(chǔ)。 本論文的研究內(nèi)容如下： 1．采用MTT法評價了100、200、300μM的鎳離子(Ni<'2+>)溶液處理小鼠結(jié)締組織成纖維細胞L929細胞12h、24h、36h、48h、60h、72h后的細胞毒性。實驗

3、結(jié)果表明，Ni<'2+>離子在100μM的濃度下對L929細胞的毒性較低，僅在處理時間達到72h時毒性級別達到1級；200μM Ni<'2+>離子在處理12h～36h時毒性影響較小，為0級毒性，處理48h～72h時毒性影響增加，為1級毒性；300μMNi<'2+>離子毒性較前兩個濃度有明顯的增強，處理24h時毒性級別即達到1級，處理時間48h以上時毒性均為2級。總體來說，細胞毒性隨著鎳離子處理濃度的增加而增強，隨著鎳離子處理時間的增加而

4、增強，具有濃度．時間的依賴性。 2．采用流式細胞儀檢測了100、200μM Ni<'2+>處理L929細胞24h、48h、72h后對細胞周期的影響。實驗結(jié)果表明，Ni<'2+>作用24h時，兩個濃度組G<,0>/G<,1>期細胞所占的比例較陰性對照組有所下降，S期和G<,2>/M期細胞所占的比例有所上升，其中S期細胞比例上升更為明顯，說明此時Ni<'2+>有促進細胞周期由G<,0>/G<,1>期向S期轉(zhuǎn)移的作用。但是隨著鎳離子作

5、用濃度的增加，這種轉(zhuǎn)移能力減弱。而當Ni<'2+>作用時間達到48h和72h的時候，兩個濃度組G<,0>/G<,1>期細胞所占的比例增加，S期和G<,2>/M期細胞所占的比例則相應(yīng)減少，說明在這兩個時間點上Ni<'2+>可能誘導了L-929細胞停留在G<,0>/G<,1>期，減少了S期細胞，從而使細胞增殖減慢。 3．根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選用100μM濃度的Ni<'2+>離子溶液分別處理L929細胞不同的時間(12h、24h、48

6、h和72h)，以及200μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h后，提取其細胞總RNA，同時提取了正常細胞的總RNA作為對照，并經(jīng)質(zhì)檢合格，以用于基因表達芯片實驗。 4．采用BioStarM-140s芯片(含14112個基因)，分別以100μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h、24h、48h和72h，200μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h后的細胞總RNA作為實驗組(共5個實驗

7、組)，以正常細胞總RNA為對照組進行了基因表達芯片實驗。每個實驗組采用兩張同型號的芯片在同樣的實驗條件下進行重復。實驗結(jié)果表明，在上述5個實驗組中發(fā)生差異表達的基因數(shù)分別為：708個、121個、97個、463個和452個，其中有效的差異表達基因數(shù)則分別為：635個、106個、85個、415個和403個。 5．在基因表達值Ratio分析以及基因功能分析的基礎(chǔ)上，篩選出了11個基因?qū)ζ浔磉_水平進行熒光定量RT-PCR的驗證。驗證結(jié)果

8、顯示，有8個基因的表達情況與芯片結(jié)果完全一致。說明通過熒光定量RT-PCR實驗技術(shù)，大部分基因的表達可以獲得驗證。 6．采用Cluster& TreeView對5個實驗組的差異表達基因(共1201個基因)進行層次聚類分析，發(fā)現(xiàn)：100μM Ni<'2+>處理24h實驗組與100μM Ni<'2+>處理48h實驗組的基因表達差異情況最為相似，其余三個實驗組的差異表達情況則各有差異。100μM Ni<'2+>處理12h、24h、48

9、h和72h后的基因表達時間模式分析顯示，上調(diào)組中基因表達模式共有14種，下調(diào)組中基因表達模式共有11種。兩者在表達模式的分布上存在著一定的差異，并且，在同一表達模式中的基因富集程度也存在不一致性。 7．利用基于GO(Gene Ontology)基因功能分類體系的GoSurfer、FatiGO+軟件，通過差異表達基因的富集程度來尋找實驗條件相關(guān)的基因功能類。分析結(jié)果顯示，差異表達基因較為富集的幾個功能類有代謝、定位、細胞通訊、生物

10、學過程的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、水解酶活性、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性等。 8．采用GenMAPP(Gene MicroArray：Pathway Profiler)軟件對5個實驗組中的差異表達基因參與的路徑進行了分析，發(fā)現(xiàn)在Local MAPPs包含的79個路徑中，有差異基因表達的路徑共57個。其中，包含差異表達基因數(shù)大于14個的路徑共有6個，分別為：粘著斑、胰島素信號、mRNA處理的結(jié)合過程、電子傳遞鏈、核糖體蛋白