α5-nAChR-HIF-1α-VEGF信號軸對人肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率居癌癥死亡率之首。2008年，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明，位于15號染色體長臂的煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic Acetylcholine Repeptors，nAChRs)基因簇CHRNA5/A3/B4的變異與吸煙相關(guān)性肺癌密切相關(guān)。其中，編碼α5-煙堿型乙酰膽堿受體（α5-nAChR）的基因CHRNA5與肺癌的發(fā)生發(fā)展尤為相關(guān)。nAChRs是由α和β亞基組成的

2、同源或異源五聚體，nAChRs廣泛表達(dá)于中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)。目前在正常組織中nAChRs的功能研究較多，而在腫瘤中功能研究很少。如果能夠明確nAChRs亞基在肺癌細(xì)胞中的功能作用，那么，以nAChRs為基礎(chǔ)的治療有可能為肺癌的治療提供新的研究思路和治療靶點。
　　 本研究通過下調(diào)α5-nAChR的表達(dá)，采用實時熒光定量PCR、Western blot、ELISA和MTT等實驗方法，體外研究肺癌細(xì)胞中α5-nAChR對缺氧誘導(dǎo)因子

3、（Hypoxia induced factor，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelial growth factor)表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信號軸對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為肺癌的預(yù)防治療尋找新靶點提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.不同濃度尼古丁，作用于肺癌細(xì)胞株A549。熒光定量PCR檢測尼古丁作用下，A549細(xì)胞中α5-nAChR、HIF

4、-1α和VEGF mRNA的表達(dá);Western bolt檢測α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá);ELISA法檢測VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 2.設(shè)計合成編碼α5-nAChR的CHRNA5基因siRNA片段，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，實時熒光定量PCR檢測siRNA-α5-nAChR后，α5-nAChR、HIF-1α和VEGFmRNA的表達(dá);Western blot檢測α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá);ELIS

5、A法檢測VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 3.MTT法檢測α5-nAChR-siRNA對尼古丁促A549細(xì)胞增殖作用的的影響。
　　 4.Western blot檢測siRNA-α5-nAChR對凋亡相關(guān)因子bcl-2和survivin的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著尼古丁濃度的增加，α5-nAChR和VEGF mRNA的表達(dá)逐漸上升，且1μmol/L尼古丁組α5-nAChR和

6、VEGF mRNA的表達(dá)升高最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而各組間HIF-1α mRNA的表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　 2.Western Blot結(jié)果顯示，隨著尼古丁濃度的增加，α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)隨尼古丁濃度的增加而增高，1μmol/L尼古丁組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)升高最明顯，而5μmol/L尼古丁組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)呈下降趨勢，表明α5-n

7、AChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)尼古丁濃度依賴性（P＜0.05）。
　　 3.ELISA結(jié)果顯示，隨著尼古丁濃度的增加，VEGF蛋白表達(dá)隨著尼古丁濃度的增加而增高，1μmol/L尼古丁組VEGF蛋白表達(dá)升高最明顯，而5μmol/L尼古丁組VEGF的蛋白表達(dá)明顯下降，表明VEGF的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)尼古丁濃度的依賴性(P＜0.05)。
　　 4.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，熒光定量PCR結(jié)果顯示，0μm

8、ol/L尼古丁組α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的相對水平為1，與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，siRNA轉(zhuǎn)染組α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)均下降(P＜0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比，(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組，α5-nAChR、HIF-1α和VEGF mRNA的相對表達(dá)均下降(P＜0.05)。
　　

9、 5.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，Western Blot結(jié)果顯示，與尼古丁0μmol/L和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，si-RNA組α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比，(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組，α5-nAChR和HIF-1α的蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　 6.CHR

10、NA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，ELISA結(jié)果顯示，與尼古丁0μmol/L和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，si-RNA組VEGF的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。與1μmol/L尼古丁組和(1μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比，(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組，VEGF的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　 7.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，無尼古丁處理組中，發(fā)現(xiàn)C

11、HRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖與陰性對照組相比，細(xì)胞增殖抑制率較對照組細(xì)胞高(P＞0.05)，尼古丁處理組，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的增殖明顯受抑制（P＜0.01)。
　　 8.CHRNA5-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，Western Blot結(jié)果顯示，與0μmol/L尼古丁組和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，si-RNA組bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。與1μmol/L尼古丁組和(1

12、μmol/LNicotine+si-NC)轉(zhuǎn)染組相比，(1μmol/L Nicotine+siRNA)轉(zhuǎn)染組，bcl-2和survivin蛋白的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.尼古丁促進(jìn)A549細(xì)胞中α5-nAChR和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)，促HIF-1α蛋白的表達(dá)，并且三者的表達(dá)都呈現(xiàn)尼古丁濃度的依賴性。
　　 2.siRNA-α5-nAChR后，能夠抑制尼古丁促肺癌細(xì)胞的增殖作

13、用。同時，HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)下降，提示α5-nAChR可能通過HIF-1α和VEGF影響肺癌細(xì)胞增殖，表明可能存在α5-nAChR/HIF-1α/VEGF信號軸，并在非小細(xì)胞肺癌的增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　 3.siRNA-α5-nAChR后，HIF-1α、VEGF、bcl-2和suvivin蛋白的表達(dá)下降，提示，α5-nAChR可能通過HIF-1α和VEGF調(diào)節(jié)bcl-2和survivin表達(dá)進(jìn)而