溫和氣單胞菌單克隆抗體的制備及初步應用.pdf

1、溫和氣單胞菌是廣泛存在于水體中的致病菌，能單獨引起魚類發(fā)病或與嗜水氣單胞菌共同引起魚類的敗血病，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。迅速、準確地診斷疾病，檢測出該病原菌，是防治該菌感染的關鍵。目前，國內外檢測魚類細菌性病原主要依賴于細菌培養(yǎng)鑒定和PCR檢測，這兩種方法均需要專業(yè)人員操作，操作復雜，費時，成本比較高，不便于在現(xiàn)場檢測。本實驗利用雜交瘤技術制備了5株可穩(wěn)定分泌抗溫和氣單胞菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對其進行鑒定、純化：在此基礎上

2、建立了檢測溫和氣單胞菌的單抗膠體金試紙條法，從而達到快速、簡單、方便檢測溫和氣單胞菌的目的。 首先，以AS免疫Balb/C小鼠，四免后以AS包被酶標板，用間接ELlSA法檢測小鼠血清。尾靜脈注射加強免疫后取效價最高的小鼠的脾臟細胞，利用50[％] PEG 4000將其與SP2/O細胞進行細胞融合，制備雜交瘤細胞。經(jīng)過對培養(yǎng)上清的篩選和雜交瘤細胞的克隆化，最終得到5株能分泌AS抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為：1A4、2C7、3G9

3、、3D5和2G3。對制備的5株雜交瘤細胞進行特異性鑒定，結果顯示2G3、1A4只與溫和氣單胞菌發(fā)生反應，與它參考菌株無反應，具有較強特異性。經(jīng)單抗亞類試劑盒測定，3株單克隆抗體2G3、1A4和3G9蛋白均為lgG，亞類分別為：IgG2<,b>，lgGl，lgGl。間接ELISA測定2G3、1A4腹水效價分別為1×10<'6>、1×10<'4>。相加試驗表明兩株單抗2G3、1A4分別識別不同的抗原表位。兩株單抗2G3和1A4的相對親和力分

4、別為1.72×10<'8>mo·L<'-1>、5×10<,8>mol·L<'-1>。結果表明，獲得的兩株單抗2G3和1A4效價高，親和力強，具有較高特異性。這兩個單抗可用于溫和氣單胞菌的臨床檢測，同時可用于溫和氣單胞菌抗原檢測方法的建立。辛酸沉淀法和DEAE-纖維素法純化單抗2G3，1A4腹水后，測得其蛋白含量分別為8.58m/mL和5.86mg/mL。本實驗利用制備所得單抗1A4標記20nm膠體金，標記膠體金穩(wěn)定。將單抗2G3、羊抗鼠