NO對大鼠腸神經(jīng)干細胞增殖分化的影響及機制研究.pdf

1、目的：一氧化氮在調(diào)控中樞神經(jīng)干細胞增殖分化、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有不可替代的作用。目前腦神經(jīng)干細胞與腸神經(jīng)干細胞的生物學(xué)特性既存在類似性又有差異性。本研究從孕15天(E15)胎鼠的消化道提取的腸神經(jīng)干細胞，通過增加外源性一氧化氮和減少內(nèi)源性一氧化氮、阻斷PI3K/AKT信號通路，研究一氧化氮對體外培養(yǎng)的大鼠腸神經(jīng)干細胞增殖、分化的調(diào)控情況、并探索可能的機制，為今后腸神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化為功能性神經(jīng)元、及在移植治療由腸神經(jīng)干細胞的缺乏或分

2、化異常所致的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷性疾病研究方面提供理論及實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．采用改良的腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方式，以反復(fù)傳代法從E15大鼠腸道提取腸神經(jīng)干細胞。
　　 2．經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及Nestin、Tuj-1、GFAP、α-SMA標(biāo)記，進行神經(jīng)干細胞鑒定；同時Brdu法測定腸神經(jīng)干細胞增殖情況。
　　 3．傳代腸神經(jīng)干細胞中分為DETA/NO50umol/L組、L-NAME100umol

3、/L組，DETA/NO(50umol/L)+L-NAME(100umol/L)組及空白組，硝酸鹽還原酶法檢測培養(yǎng)48小時后各組培養(yǎng)液中一氧化氮的濃度；流式細胞儀檢測各組腸神經(jīng)干細胞及子代細胞中Nestin、Brdu、Tuj-1染色陽性細胞百分比；流式檢測各組細胞的凋亡率。
　　 4．傳代腸神經(jīng)干細胞分為DETA/NO(50umol/L、100umol/L、200umol/L、300umol/L)組、L-NAME100umol/L

4、和空白組，培養(yǎng)48小時后流式細胞儀檢測各組雙標(biāo)nNOS+tuj-1陽性細胞百分比。
　　 5．傳代腸神經(jīng)干細胞中分別加入25umol/L和50umol/L的LY294002及空白對照組培養(yǎng)48小時后，形態(tài)學(xué)觀察分析各組的神經(jīng)球大小情況；流式細胞儀檢測比較各組腸神經(jīng)干細胞及子代細胞中Nestin、Brdu、Tuj-1染色陽性細胞百分比。
　　 6．傳代腸神經(jīng)干細胞中分別加入DETA/NO50umol/1、L-NAME100

5、umol/L，LY294002(25umol/L)及空白組培養(yǎng)1小時后，利用WesternBlot法檢測及gel-pro圖像軟件分析各組磷酸化AKT(P-AKT)和總AKT蛋白表達量及磷酸化的程度。
　　 結(jié)果：
　　 1．經(jīng)本方法原代培養(yǎng)3-4天能形成典型的神經(jīng)球，并顯示nestin、Brdu陽性，誘導(dǎo)分化細胞Tuj-1、GFAP、α-SMA顯陽性，確認(rèn)培養(yǎng)的細胞為腸神經(jīng)干細胞。
　　 2．培養(yǎng)48小時后，各組

6、與對照組相比。DETA/NO(50umol/L)組一氧化氮顯著增加(51.94±12.43umol/L)(P＜0.05)、L-NAME(100umol/L)組顯著減少(16.24±12.25umol/L)(P＜0.05)，DETA/NO(50umol/L)+L-NAME(100umol/L)組無顯著差異(P＞0.05)。形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)DETA/NO(50umol/L)組神經(jīng)球直徑較小，L-NAME(100umol/L)組神經(jīng)球直徑較大。流式

7、檢測發(fā)現(xiàn)DETA/NO(50umol/L)組腸神經(jīng)干細胞nestin百分比(16.57±1.45％)顯著降低(P＜0.05)，增殖細胞Brdu百分比(5.33±0.55％)顯著降低(P＜0.05)，神經(jīng)元Tuj-1百分比(25.59±2.78％)顯著增加(P＜0.05)，DETA/NO(50umol/L)+L-NAME(100umol/L)組與對照組無顯著差異(P＞0.05)，而L-NAME(100umol/L)組效應(yīng)相反。流式檢測并發(fā)

8、現(xiàn)各組凋亡率無顯著差異性。
　　 3．傳代培養(yǎng)48小時后發(fā)現(xiàn)DETA/NO(100umol/L.200umol/L、300umol/L)組一氧化氮合酶神經(jīng)元顯著增加(P＜0.05)、L-NAME(100umol/L)組顯著低于對照(P＜0.05)，DETA/NO(50umol/L)與對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4．形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LY294002(50umol/L)組神經(jīng)球較小、部分細胞有退化、現(xiàn)象、LY29

9、4002(25umol/L)組次之、空白對照組神經(jīng)球較大。流式檢測發(fā)現(xiàn)ly294002(25umol/L)組腸神經(jīng)干細胞nestin百分比顯著降低(P＜0.05)，增殖細胞Brdu百分比顯著降低(P＜0.05)，神經(jīng)元Tuj-1百分比顯著增加(P＜0.05)，ly294002(50umol/L)組腸神經(jīng)干細胞及神經(jīng)元百分比均顯著降低(P＜0.05)。
　　 5．WesternBlot法檢測發(fā)現(xiàn)L-NAME(100umol/L)組

10、磷酸化AKT顯著增強(P＜0.05)、而LY294002(25umol/L)組和DETA/NO(50umol/L)組均顯著降低(P＜0.05)。L-NAME組總AKT蛋白表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，而LY294002(25umol/L)組和DETA/NO(50umol/L)組均顯著降低(P＜0.05)。L-NAME(100umol/L)組磷酸化的程度顯著增強(P＜0.05)、LY294002(25umol/L)組和DETA/N

11、O(50umol/L)組均顯著降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1．DETA/NO在細胞培養(yǎng)液中能分解、釋放一氧化氮，可作為合適的外源性一氧化氮的供體之一。
　　 2．DETA/NO能抑制體外的腸神經(jīng)干細胞增殖、促進腸神經(jīng)干細胞其向神經(jīng)元分化，尤其可能向一氧化氮合酶神經(jīng)元方向分化；而L-NAME則效應(yīng)相反。
　　 3．LY294002濃度為25umol/L時對大鼠腸神經(jīng)干細胞呈抑制作用，其向神經(jīng)元分化，LY29