Brca-1基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖以及神經(jīng)干細(xì)胞移植對SD大鼠腦梗死的影響的實驗研究.pdf

1、第一部分成體SD大鼠NSCs的分離、培養(yǎng)、傳代、分化與鑒定 【目的】成體SD大鼠海馬細(xì)胞分離、純化、體外培養(yǎng)，進行神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的鑒定及增殖、分化能力的檢測。 【方法】采用機械方法分離、消化SD大鼠海馬細(xì)胞，用含有EGF和bFGF的培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；Brdu檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)；免疫熒光檢測Nestin表達(dá)和誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)元的標(biāo)記NSE及星型膠質(zhì)細(xì)胞

2、的標(biāo)記GFAP的熒光表達(dá)。 【結(jié)果】原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)均能形成較大及較多的克隆球；傳代細(xì)胞于四代左右時有大量增殖；單克隆培養(yǎng)傳代至8代以后增殖狀態(tài)明顯退化；原代、傳代以及單克隆培養(yǎng)細(xì)胞均表達(dá)Nestin陽性；誘導(dǎo)分化后細(xì)胞能夠分化為表達(dá)NSE和GFAP的陽性細(xì)胞即神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。 【結(jié)論】體外培養(yǎng)成體SD大鼠海馬細(xì)胞具有自我增殖能力及多分化潛能。體外培養(yǎng)純化法可以成功培養(yǎng)成體SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞。 第二部

3、分Brca-1基因調(diào)控NSCs增殖的實驗研究 【目的】觀察雌激素干預(yù)Brca-1基因表達(dá)后，體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化情況，初步探討B(tài)rca-1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞增殖的影響。 【方法】成體SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)后，應(yīng)用不同濃度的雌激素(10<'-5>、10<'-6>、10<'-7>、10<'-8>、10<'-9>)進行干預(yù)，設(shè)正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞為對照組。培養(yǎng)細(xì)胞隨機分為6組(n=8)，分別為：對照組；10<'-5>

4、雌激素組(E1)；10<'-6>雌激素組(E2)；10<'-7>雌激素組(E3)；10<'-8>雌激素組(E4)；10<'-9>雌激素組(E5)。應(yīng)用免疫熒光法在細(xì)胞培養(yǎng)1d、7d、14d、2ld對Nestin熒光強度和Brdu陽性細(xì)胞數(shù)進行定量分析；對培養(yǎng)的細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，做NSE及GFAP染色鑒定細(xì)胞分化能力。應(yīng)用RT-PCR法對Brca-1mRNA進行檢測；應(yīng)用Western blot對Brca-1蛋白進行檢測；對Brdu陽性細(xì)

5、胞數(shù)和Brca-1mRNA表達(dá)量做相關(guān)性分析。 【結(jié)果】①各組培養(yǎng)的細(xì)胞均表達(dá)Nestin陽性；誘導(dǎo)分化后均可檢測到NSE和GFAP陽性細(xì)胞。②細(xì)胞培養(yǎng)2ld激光共聚焦顯微鏡檢測Nestin表達(dá)：，E1、E2、E3組Nestin表達(dá)與對照組比較明顯升高(P(0.05)；E4、E5組表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。③各時間點E1、E2、E3組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)較對照組升高(P<0.05)；E4組與對照組比較，差

6、異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E5組細(xì)胞增殖較對照組數(shù)量減少(P＜0.05)。④E1、E2、E3組Brca-1 mRNA表達(dá)與對照組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；E4、E5組Brca-1 mRNA與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。E1、E2、E3組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但是Brca-1mRNA表達(dá)量的絕對值是逐漸降低的；E1、E2、E3組與E4、E5組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。⑤E1、E2、E

7、3組Brca-1蛋白表達(dá)與對照組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；E4、E5組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。E1、E2、E3組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但是Brca-1蛋白表達(dá)量的絕對值是逐漸降低的。；E1、E2、E3組與E4、E5組有統(tǒng)計學(xué)差異(P(0.05)。⑥經(jīng)相關(guān)性分析，Brca-1基因表達(dá)量與細(xì)胞增殖量呈正相關(guān)(r=0.46)。 【結(jié)論】①雌激素可以上調(diào)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞Brca-1mRNA表

8、達(dá)。②Brca-1基因可能在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖中起正向調(diào)控作用。 第三部分NSCs移植治療SD大鼠腦梗死模型的實驗研究 【目的】觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植對急性缺血性腦梗死模型SD大鼠影響。 【方法】48只SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(sham組)；腦缺血再灌注組(CIR組)；移植正常培養(yǎng)NSCs組(CN組)；移植10<'-5>濃度17β-雌二醇培養(yǎng)NSCs組(CE組)。參照Longa等線栓法建立SD大鼠急性腦梗死模型。

9、采用立體定位法，向模型大鼠病側(cè)腦室內(nèi)注射體外培養(yǎng)的成體NSCs。采用動物行為學(xué)評分評價模型動物不同時間點的神經(jīng)功能缺損；激光共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)干細(xì)胞Nestin表達(dá)；TTC染色測定不同時間點腦梗死體積變化；光鏡和電鏡分別觀察腦梗死區(qū)病理變化。免疫組織化學(xué)檢測NSE和GAFP表達(dá)。 【結(jié)果】①經(jīng)NSCs移植治療的兩組動物神經(jīng)功能恢復(fù)與未經(jīng)細(xì)胞移植治療組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三個個治療組中，經(jīng)17.B雌二醇培養(yǎng)的NSC

10、s組與正常培養(yǎng)的NSCs組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②對照組4d時熒光強度最強，7d時基本上沒有熒光表達(dá)。CN組在4d時熒光強度最強，7d時基本無熒光。其余治療組也是在4d時表現(xiàn)最強，但是持續(xù)表達(dá)高強度的時間長，7d時仍有較強熒光表達(dá)。③CIR組腦梗死體積變化不大，CN組腦梗死體積縮小，與CIR組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。CE治療組腦梗死體積明顯顯縮小，與其它兩組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。④經(jīng)雌激素調(diào)控的細(xì)胞移植

11、治療7d神經(jīng)元基本元腫脹，核仁清晰，染色質(zhì)分布正常，大部分毛細(xì)血管形態(tài)正常；正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植后治療效果好于對照組和假手術(shù)組；雌激素調(diào)控的神經(jīng)干細(xì)胞治療效果好于正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。⑤經(jīng)雌激素培養(yǎng)的NSCs治療組表達(dá)的陽性結(jié)果也高于未經(jīng)雌激素培養(yǎng)的NSCs組。統(tǒng)計學(xué)處理有統(tǒng)計學(xué)差異。NSE和GFAP的表達(dá)有逐漸增強的趨勢。以經(jīng)17 β—雌二醇10<'-5>培養(yǎng)的細(xì)胞治療組為最高。 【結(jié)論】①NSCs移植治療腦梗死模型動物