泛素結(jié)合酶UbcH10作為大腸癌診治標(biāo)志物可行性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、泛素結(jié)合酶UbcH10又稱周期蛋白選擇性泛素載體蛋白E2-C,屬于泛素結(jié)合酶E2家族的成員。在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中,UbcH10通過(guò)與具有E3連接酶活性的細(xì)胞后期促進(jìn)復(fù)合物APC相互作用,影響有絲分裂紡錘體裝配檢測(cè)點(diǎn)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展。在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑中,E2蛋白的作用是通過(guò)其活性位點(diǎn)的半胱氨酸與來(lái)自E1活化酶的泛素以硫酯鍵相連,形成Ub-E2中間體,然后直接轉(zhuǎn)移或通過(guò)E3連接酶轉(zhuǎn)移泛素至靶蛋白,泛素化的靶蛋白被26s蛋白酶體識(shí)

2、別而降解。泛素蛋白酶體系統(tǒng)具有多種生理調(diào)控功能,該系統(tǒng)功能失常能引起包括腫瘤在內(nèi)的多種病理?yè)p害。Yoshiaki Okamoto等在研究泛素結(jié)合酶E2家族成員對(duì)腫瘤發(fā)生的潛在作用時(shí),指出UbcH10是腫瘤相關(guān)性泛素結(jié)合酶。隨著一些與泛素蛋白酶體途徑相關(guān)致病蛋白的發(fā)現(xiàn)以及蛋白酶抑制劑Bortezomib對(duì)多發(fā)性骨髓瘤治療調(diào)控的認(rèn)可,特異性干涉UP-S的某一環(huán)節(jié)已被認(rèn)為足一種很有前途的創(chuàng)新性抗腫瘤治療方法。
　　 大腸癌包括直腸癌和

3、結(jié)腸癌,是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在發(fā)達(dá)國(guó)家大腸癌已成為死亡率位居第2位的惡性腫瘤。近日,由中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(huì)公布的最新數(shù)據(jù)表明大腸癌在我國(guó)目前總?cè)巳旱陌l(fā)病率為十萬(wàn)分之二十,發(fā)病率占常見(jiàn)腫瘤的第四位,2008年上海市大腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的第二位。而且,近年來(lái)發(fā)病率上升趨勢(shì)十分明顯。目前治療大腸癌首選手術(shù)以及術(shù)后常規(guī)化療,手術(shù)后5年生存率不到40％?；熀头暖煹穆?lián)合應(yīng)用取得一定療效,也不十分令人滿意。因此尋找一種新型非手

4、術(shù)干預(yù)的治療方法對(duì)于大腸癌的預(yù)防和治療具有非常重要意義。
　　 本研究中,我們首先檢測(cè)了UbcH10在大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織的表達(dá),統(tǒng)計(jì)分析了UbcH10與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。結(jié)果表明UbcH10在大腸癌患者腫瘤組織中過(guò)度表達(dá),并與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨后我們構(gòu)建了UbcH10及其siRNA真核表達(dá)載體,在細(xì)胞學(xué)水平上證實(shí)了UbcH10過(guò)表達(dá)能促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,基因沉默UocH10則能抑制大腸

5、癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。我們對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果表明UbcH10的表達(dá)能影響細(xì)胞周期分布,這也是對(duì)UbcH10表達(dá)影響細(xì)胞增殖的進(jìn)一步證實(shí)。最后,我們采用裸鼠皮下移植瘤模型研究了shRNA沉默UbcH10基因?qū)w內(nèi)大腸癌生長(zhǎng)的抑制作用。研究結(jié)果為大腸癌的基因診斷及基因治療的研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)對(duì)策。
　　 第一部分大腸癌組織中UbcH10的表達(dá)及臨床病理資料分析
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)泛素結(jié)合酶UbcH10在大腸癌組織

6、中的表達(dá),分析UbcH10與大腸癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性,探討UbcH10作為大腸癌診斷標(biāo)志物的可行性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.收集手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>5cm)凍存于-80℃冰箱。
　　 2.采用TRIzol一步法抽提組織總RNA,RT-PCR獲得UbcH10 cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大腸癌患者腫瘤組織與相應(yīng)癌旁正常組織中UbcH10 mRN

7、A的豐度。
　　 3.S-P(鏈霉卵蛋白-辣根過(guò)氧化物酶)免疫組化染色分析大腸癌組織中UbcH10的表達(dá)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析UbcH10表達(dá)與大腸癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.所有腫瘤組織樣本中UbcH10 mRNA豐度均明顯高于癌旁正常組織樣本的UbcH10 mRNA豐度(p<0.01)。
　　 2.與癌旁正常組織相比,大腸癌組織中產(chǎn)UbcH10蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<

8、0.01)。
　　 3.大腸癌組織中UoeH10的表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(p<0.05)。
　　 結(jié)論:UbcH10基因在大腸癌患者腫瘤組織中過(guò)度表達(dá),并與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示UbcH10基因表達(dá)可作為大腸癌診斷的潛在腫瘤標(biāo)記物及大腸癌基因治療的靶點(diǎn)。
　　 第二部分 UbcH10及其siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建UbcH10基因及其siRN

9、A真核表達(dá)載體。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出UbcH10 mRNA559bp的基因片斷,插入pMD-18T載體中,經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ酶切回收,插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1形成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-UbcH10。
　　 2.參考文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)UbcH10基因的siRNA片段,表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo/siRNA-UbcH10的合成與構(gòu)建由上海吉瑪制約技術(shù)有限公司完成

10、。
　　 3.表達(dá)載體pcDNA3.1-UbcH10、pGPU6/GFP/Neo/siRNA-UbcH10)及其對(duì)照轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞后,Western blot分析證實(shí)UbcH10及其siRNA真核表達(dá)載體的有效性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.測(cè)序證實(shí)RT-PCR方法從大腸癌細(xì)胞擴(kuò)增出559bp的UbcH10片斷序列正確。
　　 2.對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞行Western blot分析表明:與對(duì)照組相比,pcDNA3

11、.1-UbcH10組UbcH10蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng):pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA組UbcH10蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了UbcH10及其siRNA真核表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究UbcH10基因表達(dá)作為大腸癌診治靶標(biāo)的可行性提供了必要的工具。
　　 第三部分 UbcH10基因表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖活性及侵襲能力影響的體外研究
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?研究pcDNA3.1-UbcH10和pGPU6

12、/GFP/Neo/UbcH10-siRNA調(diào)控的UbcH10表達(dá)改變對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力以及細(xì)胞周期分布的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA、pcDNA3.1-UbcH10及其相應(yīng)空載體分別轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞HT-29及LoVo,采用FACS和熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP表達(dá),以測(cè)定大腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。
　　 2

13、.采用細(xì)胞增殖活性分析試劑盒Cell Kounting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-UbcH10、pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA及其相應(yīng)對(duì)照載體的大腸癌細(xì)胞的增殖能力。
　　 3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pcDNA3.1-UbcH10和pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA對(duì)HT-29和LoVo細(xì)胞周期分布的影響。
　　 4.采用Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)分析UbcH10

14、對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲活性的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.基因轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞超過(guò)50％,72小時(shí)GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞接近80％。
　　 2.與對(duì)照組相比,pcDNA3.1-UbcH10轉(zhuǎn)染組大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯增強(qiáng)；而pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染組大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯減弱。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:pcDNA3.1-U

15、bcH10轉(zhuǎn)染組大腸癌細(xì)胞周期分布在G2/M期明顯減少,而pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染組大腸癌細(xì)胞在G2/M期明顯增多。
　　 結(jié)論:UbcH10表達(dá)能改變大腸癌細(xì)胞周期分布,UbcH10過(guò)表達(dá)大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng),而UbcH10基因沉默的大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力受抑制,提示UbcH10基因作為大腸癌治療的靶標(biāo)是可行的,為大腸癌的基因治療研究提供了新的思路和技術(shù)對(duì)策。
　　 第四部分

16、UbcH10基因沉默對(duì)大腸癌抑制作用的體內(nèi)研究
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?建立裸鼠皮下大腸癌移植瘤模型,通過(guò)RNA干擾沉默移植瘤內(nèi)UbcH10基因的表達(dá),并觀察其對(duì)裸鼠移植大腸癌的抑制作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA(pUbcH10-RNAi)及其對(duì)照載體pGPU6/GFP/Neo/siRNA-NC(pRNAi-NC)分別轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞并通過(guò)G4

17、18篩選建立沉默細(xì)胞系HT-29/UbcH10-RNAi、HT-29/RNAi-NC以及LoVo/UbcH10-RNAi和LoVo/RNAi-NC。
　　 2.裸鼠皮下注射大腸癌細(xì)胞HT-29/UbcH10-RNAi、HT-29/PBS和HT-29/RNAi-NC以及LoVo/UbcH10-RNAi、LoVo/PBS和LoVo/RNAi-NC建立移植瘤模型,觀察腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)狀況,記錄腫瘤的出現(xiàn)時(shí)間并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

18、　　 3.腫瘤細(xì)胞接種36天后斷頸處死裸鼠,手術(shù)剝離腫瘤拍照并稱取瘤體重量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.Western blot分析證實(shí)沉默細(xì)胞系HT-29/UbcH10-RNAi和LoVo/UbcH10-RNAi中UbcH10的表達(dá)得到有效抑制。
　　 2.裸鼠皮下大腸癌移植瘤模型顯示HT-29/UbcH10-RNAi及LoVo/UbcH10-RNAi組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組,致死裸鼠時(shí)治療組腫瘤的體