基于風(fēng)險(xiǎn)決策的眼刺激性評(píng)價(jià)組合替代方法的研究.pdf

1、研究背景及目的
　　化學(xué)物質(zhì)引起的局部眼刺激作用，通常涉及結(jié)膜、角膜、虹膜和淚腺的刺激效應(yīng)，以角膜的刺激作用為首，其次是結(jié)膜、虹膜。傳統(tǒng)的眼刺激作用，采用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，鑒于其備受質(zhì)疑的合理性和倫理性，此法已不能滿足當(dāng)前產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和法規(guī)管理的需要?；隗w內(nèi)眼刺激作用發(fā)生的機(jī)制，目前已開(kāi)發(fā)了多種替代動(dòng)物試驗(yàn)的方法。單一體外方法可較好地模擬復(fù)雜眼損傷作用中的某個(gè)方面，但如何組合使用，以滿足實(shí)際工作需要，尚有待深入研究。因此，有必要

2、根據(jù)角膜損傷的發(fā)生機(jī)制，結(jié)合體外方法的原理和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用程度，對(duì)目前眼刺激實(shí)驗(yàn)的諸多替代方法的科學(xué)性和適用性進(jìn)行評(píng)估。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模⒊山M的體外方法策略，以完全取代動(dòng)物測(cè)試，滿足風(fēng)險(xiǎn)決策和安全評(píng)價(jià)的需要。
　　本研究建立雞胚尿囊膜絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)(Chicken Chorioallantoic Membrane- Trypan Blue Staining，CAM-TBS）、紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（Red blood cel

3、l haemolysis test，RBC）和SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（Short-term exposure，STE）三種眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法，并評(píng)估其單獨(dú)或組合用于風(fēng)險(xiǎn)決策系統(tǒng)的科學(xué)性和局限性。為下一步建立眼刺激實(shí)驗(yàn)體外替代方法的組合模式提供支持。以滿足替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的法規(guī)要求，也為產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的風(fēng)險(xiǎn)決策提供資料。是今后推動(dòng)我國(guó)眼刺激評(píng)價(jià)的體外標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法的鋪墊。
　　研究方法
　　1、雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（CA

4、M-TBS）
　　該實(shí)驗(yàn)利用雞胚絨毛膜尿囊膜結(jié)構(gòu)與人結(jié)膜相似的特點(diǎn)，在定性觀察的基礎(chǔ)上，建立定量檢測(cè)的方法。通過(guò)觀察化合物作用于CAM引發(fā)出血、血管溶解和凝血反應(yīng)的損傷程度，并測(cè)定CAM吸收臺(tái)盼藍(lán)的量，從而定量檢測(cè)受試物損傷作用，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。
　　2、紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（RBC）
　　通常具有眼刺激作用的物質(zhì)也能使蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞膜溶解。將化合物直接接觸哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，通過(guò)定量檢測(cè)紅細(xì)胞溶血，以及釋放出細(xì)胞外的

5、血紅蛋白變性程度，模擬類似角膜的損傷作用。
　　3、SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE）
　　化合物直接作用于角膜引起的刺激作用類似于細(xì)胞毒性損傷作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，可反應(yīng)角膜損傷的程度。實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的兔角膜細(xì)胞（SIRC），短期暴露細(xì)胞于化合物，模擬急性角膜刺激作用，計(jì)算細(xì)胞活性、生長(zhǎng)的抑制程度，及其與化學(xué)物的濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　4、提出替代方法的組合策略
　　基于危害物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基本理論與原則，

6、在參考國(guó)內(nèi)外眼刺激試驗(yàn)最新法規(guī)認(rèn)可與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，提出以三種替代方法為主體的眼刺激試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估組合策略。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（CAM-TBS）
　　苔盼藍(lán)濃度與吸光度OD值間存在正相關(guān)，回歸模型表達(dá)式為
　　y=0.2968+0.0004x
　　回歸系數(shù)的區(qū)間估計(jì)：95％CI=[0.0002，0.0005]。R2=0.8994，表明利用苔盼藍(lán)濃度變量可以解釋吸光度OD值變

7、異情況的89.94%。
　　2、紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（RBC）
　　對(duì)RBC實(shí)驗(yàn)與Draize實(shí)驗(yàn)的受試物分類做配對(duì)資料的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，得S=1.8182，p=0.9976，在檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05的水平下，兩者之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)一致性檢驗(yàn)，得出Kappa=0.6356，置信區(qū)間為[0.3930,0.8781]；RBC實(shí)驗(yàn)和Draize兔眼實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較好。
　　3、 SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（S

8、TE）
　　SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE）所分的結(jié)果，與 Draize兔眼實(shí)驗(yàn)分類結(jié)果相比較，經(jīng)過(guò)kappa一致性檢驗(yàn)，kappa值=0.6316，95%可信區(qū)間為[0.4040,0.8592]，兩種分類一致性較好。
　　4、替代方法組合試驗(yàn)策略
　　本組合適用于無(wú)刺激性到嚴(yán)重刺激性范圍內(nèi)眼刺激危害性的評(píng)價(jià)，對(duì)于無(wú)刺激性到中等刺激性的區(qū)分優(yōu)勢(shì)明顯，三種方法組合流程見(jiàn)下圖。
　　根據(jù)受試物的理化特性，預(yù)期為有刺

9、激性的物質(zhì)先進(jìn)行CAM-TBS測(cè)試，若測(cè)試結(jié)果為嚴(yán)重刺激性，則可直接分類為嚴(yán)重刺激性；若測(cè)試結(jié)果為非嚴(yán)重刺激性，則進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測(cè)試或紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則進(jìn)行紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，其它物質(zhì)則選擇細(xì)胞短期暴露試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可對(duì)受試物眼刺激性分類。
　　預(yù)期為無(wú)刺激性的物質(zhì)，若為可溶性物質(zhì)或配方，先進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測(cè)試，若測(cè)試結(jié)果為無(wú)刺激性，則可直接分類為無(wú)刺激性；若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則需

10、要補(bǔ)充紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)加以確認(rèn)或直接用此法進(jìn)行測(cè)試。若結(jié)果有刺激性，則進(jìn)行CAM-TBS測(cè)試，確認(rèn)并區(qū)分刺激的嚴(yán)重程度。
　　結(jié)論
　　本研究選擇CAM-TBS、RBC和STE三種眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法，模擬結(jié)膜和角膜受損的機(jī)制，在改進(jìn)試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)上，探索建立替代實(shí)驗(yàn)組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Draize兔眼實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，這三種方法的體內(nèi)相關(guān)性、分級(jí)一致性和結(jié)果重現(xiàn)性均良好。
　　三種方法均可定量檢測(cè)化合物的眼刺激性。并且

11、三者適用于不同的化合物，化合物的眼刺激性分類范圍也不同。對(duì)于嚴(yán)重刺激性物質(zhì)，CAM-TBS實(shí)驗(yàn)分類較好；中等/溫和刺激性物質(zhì)分類，RBC實(shí)驗(yàn)分類較好；弱/無(wú)刺激性物質(zhì)分類，STE實(shí)驗(yàn)分類較好。CAM-TBS實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)試單一化合物或混合物，該方法不適合用于有色嚴(yán)重刺激性物質(zhì)的分類。RBC實(shí)驗(yàn)與 STE實(shí)驗(yàn)適用于可溶解性物質(zhì)的檢測(cè)，但不適用于難溶物質(zhì)或混合物的測(cè)試，且前者對(duì)表面活性劑更敏感。
　　綜合考慮三種方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，初步