大鼠腰髓節(jié)段突觸網(wǎng)絡(luò)形成的生后發(fā)育.pdf

1、已知外周軀體感覺信息產(chǎn)生于外周感受器，然后經(jīng)由位于背根節(jié)的支配外周感受器的初級感覺神經(jīng)元的中樞突傳遞至脊髓。一般認(rèn)為支配軀體的大的粗髓纖維（Aβ）主要經(jīng)后索上行至腦干后索核，主司本體覺、壓覺和精細觸覺等非傷害感覺信息處理；而小的薄髓（Aδ）和無髓（C）纖維主要進入脊髓背角，主司傷害性感覺信息處理。很多神經(jīng)解剖學(xué)與電生理學(xué)實驗證據(jù)表明，一部分Aβ纖維中樞突從后索沿上下2-3個節(jié)段進入脊髓背角，而且有可能參與了傷害性信息的調(diào)節(jié)，如當(dāng)前臨床日

2、趨成熟的脊髓電刺激（spinal cord stimulation，SCS)技術(shù)就是通過在后索硬膜外埋置刺激電極（50 Hz，0.2 ms脈沖，30分鐘）而實現(xiàn)鎮(zhèn)痛的。由于技術(shù)限制，在過去的100年來雖然了解到 Aβ纖維在脊髓背角有分布，但對其功能了解甚少。本博士學(xué)位論文結(jié)合初級傳入的神經(jīng)化學(xué)、髓鞘透射電鏡觀察和先進的平面微電極陣列記錄技術(shù)，從生后發(fā)育的角度出發(fā)系統(tǒng)地研究了大鼠腰髓節(jié)段非傷害性初級傳入和傷害性初級傳入突觸網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能形

3、成的生后發(fā)育特點，旨在為今后研究和揭示后索Aβ纖維參與脊髓節(jié)段傷害性信息調(diào)節(jié)的神經(jīng)機制建立一個新的研究方法和模型。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分大鼠腰髓節(jié)段生后發(fā)育的結(jié)構(gòu)特點及研究脊髓突觸網(wǎng)絡(luò)實驗方法的建立
　　首先應(yīng)用免疫組化抗NeuN染色，對生后（postnatal，P）第7天（P7）、第14天（P14）和第28天（P28）大鼠腰髓（L4-5）的橫（冠狀）切面進行細胞構(gòu)筑觀察，確定8X8（64道）平面

4、微電極陣列記錄電極的大小和型號。本實驗室采用的是日本Alpha Med Scientific公司開發(fā)的MED-64系統(tǒng)及其專用電極（MED-64 Probe）。根據(jù)大鼠腰髓橫切面的細胞構(gòu)筑和Rexed分層，本實驗選用型號MED-P210A（電極總面積0.7x0.7 mm，大小20x20μm，電極間距100μ m，培養(yǎng)皿高度10 mm）用于P7，選用型號MED-P515A（電極總面積1x1 mm，大小50x50μ m，電極間距150μ m

5、，培養(yǎng)皿高度10 mm）用于P14和P28的脊髓薄片（450-500μ m厚）。制作本實驗標(biāo)本的難點是在切取脊髓薄片時要保留脊髓背根，實現(xiàn)在一張脊髓薄片上先后完成電刺激背根和電刺激后索在脊髓背角誘發(fā)出網(wǎng)絡(luò)突觸后場電位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP）的記錄。這是保障本實驗進展順利的前提。
　　第二部分大鼠脊髓腰髓節(jié)段初級傳入神經(jīng)化學(xué)和髓鞘的生后發(fā)育
　　為了觀察經(jīng)由

6、背根進入脊髓背角的傷害性和經(jīng)由后索進入脊髓背角的非傷害性初級傳入的生后發(fā)育特點和結(jié)構(gòu)特征，本部分實驗采用了免疫組化或免疫熒光化學(xué)標(biāo)記技術(shù)。用抗P物質(zhì)（substance P，SP）和異植物凝集素B4（isolectin B4，IB4）抗體標(biāo)記肽能和非肽能的C類纖維，用抗神經(jīng)微絲蛋白（neurofilament200，NF200）抗體標(biāo)記 A類纖維，用抗少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（myelin oligodendroglia glycoprote

7、in，MOG）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體來標(biāo)記有髓纖維髓鞘的生后發(fā)育特征。肽能和非肽能的C類纖維在脊髓背角生后發(fā)育分布特征如下：（1）SP樣肽能纖維終末在P7-P14廣泛地分布于背角淺層（I-II）和深層（III-VI），而在P28成熟后只分布于淺層；（2）IB4樣非肽能纖維終末在P7-P28只分布于背角淺層。NF200樣纖維標(biāo)記成分在P7-P14主要分布于脊髓白質(zhì)（后索、側(cè)索和前索）和背角深

8、層，但也見于背角淺層，P28時背角淺層內(nèi)標(biāo)記成分消失。結(jié)合常規(guī)透射電鏡和髓鞘相關(guān)蛋白免疫組化標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)有髓纖維髓鞘有顯著生后發(fā)育特點。在后索，P7時約有20-30％纖維有髓鞘，且基本沒有厚髓纖維，纖維直徑小于5μ m，P14時有髓纖維增加至50-60%，未見5μ m以上厚髓纖維，P28時幾乎所有纖維均有髓鞘包繞，可見直徑大于5μ m的厚髓纖維。在后索，MBP樣和MOG樣免疫陽性產(chǎn)物在P7有極少量表達，在P14表達豐度顯著增高，P28

9、表達達最高。在脊髓背角MBP樣和MOG樣免疫陽性產(chǎn)物可見于穿行于其中的上下行纖維束和后索纖維，其它部位少見。
　　第三部分應(yīng)用平面微電極陣列記錄技術(shù)研究腰髓節(jié)段突觸網(wǎng)絡(luò)形成的生后發(fā)育
　　用8×8（64道）平面微電極陣列記錄技術(shù)，可以同步記錄刺激脊髓背根或刺激脊髓后索誘發(fā)的網(wǎng)絡(luò)fEPSP，以此觀察和記錄傷害性初級傳入和非傷害性初級傳入在脊髓背角形成的網(wǎng)絡(luò)突觸聯(lián)系和功能的生后發(fā)育特點。在刺激背根的條件下，在背角記錄到的fEPS

10、P網(wǎng)絡(luò)主要分布于背角淺層，但P7和P14時也見于深層。背角淺層的fEPSP波形為主波向下的負(fù)向波，波幅隨年齡增加而逐漸減?。辉谏顚佑涗浀降膄EPSP主波方向始終雙峰向上，幅度隨年齡增加而逐漸減小，范圍則隨年齡增加而逐漸縮小，并向脊髓背角淺層集中，峰值潛伏期在各層記錄隨年齡增大而變短。在刺激后索的條件下，在背角記錄到的fEPSP網(wǎng)絡(luò)主要分布于背角深層，但P7和P14時也見于淺層。各年齡組淺層波形為雙向，波幅隨年齡增加而減小，深層主波為負(fù)向

11、，波幅隨年齡增加而減小，各層峰值潛伏期則隨年齡增加而變短。藥理學(xué)檢測脊髓薄片灌流谷氨酸離子門控型非NMDA和NMDA受體拮抗劑CNQX和AP5以及鈉通道阻斷劑河豚毒素的效果，結(jié)果證明無論刺激背根還是后索，在脊髓背角誘發(fā)的場電位主要由非NMDA（AMPA/KA）受體介導(dǎo)，而NMDA受體作用較小。
　　結(jié)論：
　　大鼠腰髓傷害性和非傷害性初級感覺纖維傳入在脊髓背角節(jié)段形成的突觸聯(lián)系均具有生后年齡結(jié)構(gòu)和功能。（1）經(jīng)由后索進入脊髓

12、背角的初級傳入纖維在生后具有顯著的年齡變化特征，即后索纖維從小直徑（<5μ m）到大直徑（>5μ m），從部分有髓（70-80%是無髓纖維）到全部有髓、從無厚髓（主要是薄髓）到有厚髓纖維的發(fā)育過程，該生后發(fā)育過程對其在脊髓背角形成的突觸聯(lián)系和功能具有重要影響。（2）經(jīng)由背根進入脊髓背角的初級傳入纖維在生后具有顯著年齡變化特征的是肽能纖維，該類纖維在生后散在地分布于背角的淺層和深層，成熟后局限于淺層。但非肽能纖維在生后無變化，僅分布于背角

13、淺層的II層，因此在P7和P14刺激背根在背角深層誘發(fā)的fEPSP主要由肽能纖維介導(dǎo)，而在淺層誘發(fā)出fEPSP由肽能和非肽能纖維共同介導(dǎo)。（3）預(yù)實驗結(jié)果表明在給予成年脊髓后索高頻電刺激后可以顯著抑制刺激背根誘發(fā)的fEPSP，提示除了下行痛抑制系統(tǒng)之外，經(jīng)由后索進入脊髓背角的初級傳入纖維在脊髓形成節(jié)段神經(jīng)調(diào)控回路，這可能是SCS鎮(zhèn)痛的神經(jīng)機制之一。（4）用8×8（64道）平面微電極陣列記錄技術(shù)研究脊髓后索傳入和背根傳入纖維突觸聯(lián)系和功能