YAP在大鼠不同節(jié)段髓核細(xì)胞中的表達(dá)初探.pdf

1、目的:
　　探討大鼠不同節(jié)段髓核細(xì)胞中YAP的表達(dá)情況;觀察不同細(xì)胞密度下YAP信號通路激活情況;在體外模擬椎間盤血清剝奪的微環(huán)境下YAP的表達(dá)情況。
　　方法:
　　1、體外連續(xù)傳代、培養(yǎng)SD大鼠正常的腰椎髓核細(xì)胞、尾椎髓核細(xì)胞;觀察P0代腰椎髓核細(xì)胞中不同形態(tài)髓核細(xì)胞的增殖情況;
　　2、分別培養(yǎng)至P3代，觀察各髓核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;
　　3、免疫熒光法觀察P3代腰椎髓核細(xì)胞中YAP的表達(dá);
　　

2、4、各髓核細(xì)胞在P3代時，同時對50％融合狀態(tài)下腰椎髓核細(xì)胞（A組），90％融合狀態(tài)下腰椎髓核細(xì)胞（B組），50％融合狀態(tài)下尾椎髓核細(xì)胞（C組），90％融合狀態(tài)下尾椎髓核細(xì)胞（D組），共四組細(xì)胞行RT-PCR檢測細(xì)胞中YAP的表達(dá)差異;
　　5、同時對步驟4中50％及90％融合狀態(tài)下的腰椎髓核細(xì)胞與尾椎髓核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)行Western-blot檢測，依次命名An、Ac、Bn、Bc、Cn、Cc、Dn、Dc，對比YAP表達(dá)差異

3、;
　　6、尾椎髓核細(xì)胞正常傳代至P3代后，予以營養(yǎng)剝奪，用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，10天后對含血清的髓核細(xì)胞與不含血清的髓核細(xì)胞行Western-blot檢測YAP蛋白表達(dá)情況，進(jìn)行對比。
　　結(jié)果:
　　1、不同髓核細(xì)胞在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)周期不同，提示增殖情況不一，其中腰椎髓核細(xì)胞培養(yǎng)周期較尾椎髓核細(xì)胞增殖周期長;P0代髓核細(xì)胞中存在不同形態(tài)的細(xì)胞，腰椎以短梭形或多角形為主，尾椎以圓形或橢圓形為主;隨著傳代次數(shù)的增多，

4、部分髓核細(xì)胞向長梭形轉(zhuǎn)變;P0代尾椎髓核細(xì)胞中存在內(nèi)含大空泡的脊索樣髓核細(xì)胞;
　　2、P3代腰椎髓核細(xì)胞在低密度接觸時，免疫熒光法檢測提示細(xì)胞核中高表達(dá)YAP蛋白;高密度接觸時，提示細(xì)胞漿高表達(dá)YAP蛋白;
　　3、RT-PCR檢測50％及90％融合狀態(tài)下的腰椎髓核細(xì)胞和尾椎髓核細(xì)胞中YAP的表達(dá)，實驗結(jié)果顯示，B組YAP表達(dá)較A組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);C組YAP表達(dá)較A組稍增多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0

5、.05);B組YAP表達(dá)較D組稍減少，無統(tǒng)計學(xué)差異;C組YAP表達(dá)較D組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、Western-blot檢測提示腰椎髓核細(xì)胞與尾椎髓核細(xì)胞在50％融合狀態(tài)下的核內(nèi)YAP表達(dá)較90％融合狀態(tài)下表達(dá)高，胞質(zhì)表達(dá)低，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、營養(yǎng)剝奪組尾椎髓核細(xì)胞總YAP表達(dá)較正常組表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　1、髓核細(xì)胞中存在YAP蛋白的表達(dá);
　　2、尾椎髓核細(xì)