ErmB導致大環(huán)內酯耐藥的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、大環(huán)內酯類抗生素在臨床廣泛應用,主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染,而細菌對大環(huán)內酯耐藥現(xiàn)象日益嚴重。甲基化酶erm基因是導致大環(huán)內酯高水平耐藥的重要機制之一。文獻認為erm催化23S rRNA2058位腺嘌呤核苷酸的修飾,使其單甲基化或二甲基化。甲基化后的空間結構使細菌與大環(huán)內酯的結合位點被隱藏,阻斷了大環(huán)內酯等抗生素與細菌核糖體之間的結合,從而導致大環(huán)內酯、林可酰胺及鏈霉殺陽菌素耐藥。但是erm甲基化作用機制及其對細菌耐藥程度的貢獻

2、在國際國內尚未見報道。
  本實驗室于臨床發(fā)病雛鴨腦和脾臟中分離的解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種(S.gallolyticus subsp.pasteurianus)中發(fā)現(xiàn)耐藥基因ermB和ermT,且這兩種erm基因介導這些分離株大環(huán)內酯高水平耐藥。此外,我們還發(fā)現(xiàn)不同分離株中ermB單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)引起ermB突變,且其大環(huán)內酯MIC存在差異。為了探討erm甲基化

3、作用機制及其對大環(huán)內酯耐藥的貢獻,本研究優(yōu)化了ermB和ermT表達體系,選取了ermB進行研究,并基于生物信息學分析及臨床分離株中的SNP構建了32種ermB突變體,首次利用微量稀釋法對這32種突變體進行篩選,選取了六個突變體,分別檢測了它們對23S rRNA的甲基化活性和對大環(huán)內酯及林可酰胺的最小抑菌濃度(MIC)。研究結果如下:
  1、ermB、ermT甲基化酶表達載體的構建與純化及23S rRNA的分離純化
  將

4、ermT耐藥基因分別構建到pET28a、pET15b載體上,ermB耐藥基因分別構建到pET21b、 pET28a載體上,比較蛋白分離純化結果,選擇ermB、ermT構建至pET28a載體的克隆,利用親和層析純化出ErmB、ErmT蛋白、MBP-MS2蛋白以及S.gallolyticus subsp.pasteurianus23S rRNA。
  2、ermB、ermT的甲基化活性比較
  用3H標記S-腺苷甲硫氨酸為甲基供

5、體,23S rRNA為底物,對ErmB、ErmT進行酶促動力學試驗。兩個蛋白的甲基化活性通過液閃儀檢測轉移到23S rRNA上3H的放射性強度完成。試驗結果表明,ErmB和ErmT均可以甲基化修飾S.gallolyticussubsp.pasteurianus23S rRNA,但ermB甲基化活性要低于ermT。
  3、ermB突變體構建
  結合實驗室前期解沒食子酸鏈球菌分離株中ermB的SNP,我們選取ermB進行研究

6、。運用生物信息學方法分析erm及ermB同源序列,對ermB保守區(qū)域部分氨基酸殘基進行突變,構建了32個突變體。
  4、ermB、ermB突變體MIC值檢測粗篩
  對ermB及其32個突變體進行MIC值檢測。結果表明,與野生型ermB的MIC值相比,32株突變體中對紅霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);對林可酰胺MIC降低的突變體包括:突

7、變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);對克拉霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株58-1(ES8A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)。
  5、微量稀釋法測定6株突變體的MIC值
  通過ermB、ermB突變體MIC值檢測粗篩選擇6株ermB突變體進行精確MIC值檢測,檢測結果顯示,突變菌株

8、83-1(D83A)對紅霉素、克拉霉素、林可酰胺的MIC值分別為:512μg/mL、64μg/mL、512μg/mL;突變菌株139139(R139A)對三種抗生素的MIC值分別為:512μg/mL、64μg/mL、128μg/mL;突變菌株165165(K165A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、128μg/mL、128μg/mL;突變菌株4040(K40A)對三種抗生素的MIC值分別為512μg/mL、128μg/

9、mL、256μg/mL;突變菌株37(G37A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、256μg/mL、512μg/mL;突變菌株39(G39A)對三種抗生素的MIC值分別為:1024μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL。
  6、ermB及ermB突變體甲基化活性比較
  用3H標記S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,23S rRNA為底物,對野生型及突變體ErmB的甲基化活性進行檢測。試驗結果表明,突變體

10、37(G37A)、39(G39A)酶活性高于野生型ermB甲基化酶活性,突變體40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)酶活性小于野生型ermB甲基化酶活性。
  7、ermB甲基化酶生物進化樹構建
  利用Mrbays3.1.2生物信息學軟件對ermB不同物種進行同源性分析,構建了ermB甲基化酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。
  結論:ermB、ermT基因構建到pET28a載體上蛋白純化效

11、果較好。構建的32個ermB突變體與野生型ermB的MIC值相比,對紅霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);對林可酰胺MIC降低的突變體包括:突變菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);對克拉霉素MIC降低的突變體包括:突變菌株58-1(E58A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D

12、83A)、139(R139A)、165(K165A)。
  突變菌株37(G37A)、39(G39A)獲得的酶活性大于野生型ermB,突變菌株40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)獲得的酶活性小于野生型ermB,與MIC值變化趨勢相符。以上結果說明,氨基酸K40、D83、R139及K165對ermB甲基化活性具有重要作用,這些氨基酸殘基進一步影響大環(huán)內酯耐藥。本研究為揭示大環(huán)內酯耐藥機制

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