大環(huán)內(nèi)酯衍生物抗菌活性篩選及抗菌機制初步研究.pdf

1、近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥呈逐年上升趨勢，給感染性疾病的治療帶來極大的困難。因此，日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題促進了抗耐藥菌活性化合物的篩選及機制研究工作。本研究篩選了一批大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的抗耐藥菌活性，得到三個活性較好的化合物，對其藥效學(xué)進行評價，并進一步對其抗菌作用機制進行了初步研究。
　　 一、大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的抗菌活性篩選
　　 以最低抑菌濃度(MIC，minimalinhibit

2、oryconcentration)作為指標(biāo)評價待測化合物的抗菌活性，MIC的測定以微量稀釋法采用大環(huán)內(nèi)酯耐藥的肺炎鏈球菌株，篩選了C、F、J、K、L、M、N、O八個系列共105個大環(huán)內(nèi)酯類衍生物。得到了三個具有較好抗菌活性的化合物，分別為C6、C7、F7。三者對肺炎鏈球菌耐藥株的MIC值在0.06～2μg/ml之間，抗菌效果明顯優(yōu)于對照藥組（紅霉素，克拉霉素及阿奇霉素對照）。
　　 二、體外抗菌作用研究
　　 該部分對前

3、期篩選出的化合物C6、C7、F7進行進一步的藥效學(xué)研究。采用臨床新近分離的8株肺炎鏈球菌耐藥株對其進行抗菌活性篩選，進行了MIC及MBC的測定，并對這8株細(xì)菌的耐藥基因ermB，ermA的表達進行檢測，確定了其主要耐藥機制。觀察了pH值、細(xì)菌接種量對待測化合物抗菌活性的影響，并繪制了化合物F7的殺菌曲線。
　　 1.C6、C7、F7對臨床分離株的抗菌活性
　　 臨床分離耐藥株中有6株為甲基化耐藥株，2株為混合耐藥株。所篩

4、選出的三個化合物對臨床分離株也具有很好的抗菌效果，MIC值均小于2μg/ml，在高濃度下顯示殺菌效果，MBC約為MIC值的4～32倍。
　　 2.培養(yǎng)條件對C6、C7、F7抗菌活性的影響
　　 細(xì)菌接種量由103增加至107CFU/ml時，MIC值約升高4～64倍，培養(yǎng)基的pH值由5增加到9時，MIC值隨之降低約32～258倍。表明細(xì)菌接種量、pH值均對MIC有影響。當(dāng)pH值為9時，MIC值最小，說明所測化合物在堿性條件

5、下具有更強的抗菌效果。
　　 3.殺菌曲線
　　 在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入不同濃度的待測藥物，在不同時間點取一定量的培養(yǎng)基進行菌落計數(shù)，繪制出化合物F7的殺菌曲線。結(jié)果表明，F(xiàn)7對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌只顯現(xiàn)出抑菌作用。而在4×MIC時，對肺炎鏈球菌顯示出殺菌作用。
　　 三、體內(nèi)抗菌活性研究
　　 選擇F7，對其體內(nèi)抗菌活性進行評價。肺炎鏈球菌經(jīng)提毒后確定100％最小致死量。將小鼠進行隨機分組，分為F7

6、高、中、低劑量組，紅霉素對照組及空白對照組。用所確定的最小致死量腹腔注射感染小鼠，感染后立即靜脈注射受試藥物，并在給藥6小時后再次給藥。給藥后觀察5～7天，記錄各組小鼠存活數(shù)，并確定ED50，結(jié)果顯示ED50值為24.83mg/kg。
　　 四、F7細(xì)胞毒性檢測
　　 通過MTT法檢測F7對人體正常肝細(xì)胞活性影響。結(jié)果顯示，隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞毒性逐漸增大，TC50值為17.04μg/ml。
　　 五、抗菌

7、機制初步研究
　　 1.F7對細(xì)菌形態(tài)的影響
　　 通過電鏡觀察了F7對肺炎鏈球菌外部形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)F7作用后，細(xì)菌的外部形態(tài)嚴(yán)重扭曲變形呈不規(guī)則形，部分細(xì)菌嚴(yán)重皺縮，表面出現(xiàn)隆起或凹陷;細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜出現(xiàn)部分缺損，細(xì)胞內(nèi)核電子密度大大降低，甚至出現(xiàn)大塊、不均一的透電子區(qū)。
　　 2.F7對肺炎鏈球菌耐藥基因mefA及ermB表達的影響
　　 采用RT-PCR法檢測F7對肺炎鏈球

8、菌外排泵耐藥基因mefA及甲基化耐藥基因ermB表達的影響。實驗所用菌株為肺炎鏈球菌混合耐藥株(A+B14)，實驗分為空白對照組，藥后4h、8h、12h組。結(jié)果顯示:給藥組的耐藥基因mefA及ermB的表達量有所降低，且其降低趨勢呈一定的時間依賴性。表明F7能夠明顯抑制肺炎鏈球菌耐藥基因mRNA水平的表達。
　　 3.F7對細(xì)菌體內(nèi)DNA及蛋白含量的影響
　　 采用DAPI染色法檢測藥物作用后細(xì)菌體內(nèi)DNA含量的變化，結(jié)