骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療血管性癡呆模型鼠的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，觀察其生物學特性并對其進行鑒定和標記。 方法：采用全骨髓貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠MSCs，相差顯微鏡觀察MSCs細胞形態(tài)，透射電鏡觀察MSCs超微結(jié)構(gòu)并繪制生長曲線，分別使用成骨細胞誘導(dǎo)液和脂肪細胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向成骨細胞和脂肪細胞兩個方向分化。用BrdU對MSCs進行體外標記，

2、通過免疫組化染色觀察并計算BrdU陽性細胞標記率。 結(jié)果：分離培養(yǎng)的MSCs為貼壁生長的成纖維樣細胞，傳代后的細胞均一性好。超微結(jié)構(gòu)顯示MSCs核質(zhì)比大，胞漿可見較豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等，細胞表面有大量微絨毛。第3代MSCs生長曲線呈S形，經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)增殖期和停滯期。經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs能分化為成骨細胞和脂肪細胞，茜素紅S和油紅O染色陽性。10μ mol/L BrdU體外孵育48h后標記率為90％。 結(jié)論：體外MSC

3、s易于分離、培養(yǎng)和擴增。體外培養(yǎng)的MSCs有獨特的超微結(jié)構(gòu)特點。MSCs具有多向分化潛能，可通過誘導(dǎo)向成骨細胞和脂肪細胞分化。用BrdU標記MSCs的濃度為10μmol/L，時間為48h。 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對血管性癡呆大鼠學習記憶功能及對BDNF表達的影響 目的：建立2-VO血管性癡呆大鼠模型。探討MSCs在VD大鼠腦組織中的存活情況，MSCs對VD大鼠空間學習記憶功能、病理改變及腦組織內(nèi)BDNF表達的影響。

4、 方法：①將11～13月齡的SD大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組(n=10)，暴露雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎；模型對照組(n=15)，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)，30d后腦立體定位將10μl PBS注入大鼠海馬內(nèi)；MSCs治療組(n=15)，2-V030d后腦立體定位將1×106 MSCs移植入大鼠海馬內(nèi)。②飼養(yǎng)4w后以Morris水迷宮檢測各組大鼠空間學習記憶能力。③HE染色后光鏡下觀察各組大鼠海馬區(qū)和額葉的病理變化。④免疫組織化學染色

5、觀察BrdU標記的MSCs在VD大鼠腦組織中的存活情況及BDNF在各組大鼠腦組織中的表達情況并進行分析。 結(jié)果：①造模前各組大鼠Morris水迷宮檢測成績差別無統(tǒng)計學意義，海馬定位移植4w后，模型對照組與假手術(shù)組比較，平均逃避潛伏期長(P<0.01)，且60s內(nèi)在原平臺象限滯留時間短(P<0.01)。而MSCs治療組測試成績優(yōu)于模型對照組。②光鏡下可見模型對照組細胞核固縮，胞質(zhì)密度增高，細胞脫失。而MSCs治療組上述病理改變減輕

6、。③MSCs移植4w后可在海馬及額葉觀察到BrdU標記的MSCs。④海馬定位移植4w后，模型對照組海馬及額葉的BDNF表達較假手術(shù)組少(P<0.05)，而MSCs治療組BDNF表達較模型對照組高(P<0.05)。 結(jié)論：①MSCs移植4W后，VD大鼠空間學習記憶能力得到改善。②BrdU免疫組化染色證實MSCs能夠在移植鼠腦內(nèi)存活并遷移。③MSCs可以增加VD大鼠腦內(nèi)BDNF的表達，提示MSCs可能通過增加BDNF的表達改善VD大