骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病模型鼠的研究.pdf

1、帕金森病(PD)是一種錐體外系疾病，主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性變性和壞死。由于患者的黑質(zhì)紋狀體通路受損，導(dǎo)致黑質(zhì)轉(zhuǎn)運到紋狀體的多巴胺含量減少，從而引起靜止性震顫、肌強直和運動障礙等臨床癥侯群。目前神經(jīng)干細(xì)胞和胎腦組織的移植被認(rèn)為是可能有潛在應(yīng)用價值的手段，但由于存在倫理問題和免疫排斥等問題，限制了它們在臨床上的應(yīng)用。因此，最理想的移植是移植物既能保持一定的數(shù)量和長期在體內(nèi)存活，而且能產(chǎn)生多巴胺和分泌各種營養(yǎng)因子，從而改善移

2、植區(qū)的營養(yǎng)狀況和阻止PD進(jìn)行性惡化，達(dá)到治愈PD的目的。本研究首先從體外探討了骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemesenchymalstemcell，MSCs)神經(jīng)分化的可能性，研究了MSCs對MPP+損傷的離體腦片的保護(hù)作用及其機理。在此基礎(chǔ)上，將MSCs移植至PD模型鼠腦內(nèi)，應(yīng)用MR成像技術(shù)在體觀察了移植的MSCs在腦內(nèi)分布和遷徙情況，探討了MSCs移植治療PD的效果，為MSCs移植治療PD提供了有價值的實驗依據(jù)。 第一部分體外不

3、同培養(yǎng)條件對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化的影響 目的：探討不同條件培養(yǎng)的MSCs能否在體外向神經(jīng)細(xì)胞分化的可能性。 方法：取成年大鼠骨髓，培養(yǎng)、分離和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將培養(yǎng)的第4代MSCs隨機分為五組，其中三組分別置于DMEM+FBS、干細(xì)胞培養(yǎng)基和神經(jīng)元培養(yǎng)基，另兩組分別與神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)和離體紋狀體腦片共培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)改變，用免疫熒光組化技術(shù)對分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，用RT-PCR檢測不同條件培養(yǎng)

4、的MSCs部分標(biāo)志基因的表達(dá)。 結(jié)果：MSCs與神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)14天，大部分MSCs的細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞呈長扁平狀。少量的MSCs形態(tài)呈強折光的錐形或圓形胞體以及有長的多極突起，免疫熒光顯示它們明顯地表達(dá)了MAP-2和GFAP；MSCs與離體腦片共培養(yǎng)14天，部分MSCs細(xì)胞核變大并生成突起，有很強的Nestin表達(dá)；用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的其他三組MSCs未發(fā)生明顯的變化。RT-PCR結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的MSC

5、s，其Nestin、GFAP和MAP-2的基因表達(dá)亦無明顯變化。 結(jié)論：MSCs與神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)或MSCs與腦片之間的接觸是MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的重要條件。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對離體大鼠紋狀體-黑質(zhì)腦片的作用 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對MPP+損傷的離體黑質(zhì)-紋狀體腦片多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用以及對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響。 方法：建立MPP+損傷的離體腦片模型。取成年大鼠骨髓，培養(yǎng)、分離和純化骨髓

6、間充質(zhì)干細(xì)胞。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與離體腦片聯(lián)合培養(yǎng)，通過免疫組化和電鏡等方法觀察骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞對聯(lián)合培養(yǎng)的MPP+損傷腦片的保護(hù)作用。用高效液相色譜分析腦片和培液中多巴胺及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥苯乙酸和高香草酸水平的變化。 結(jié)果：MPP+可造成離體黑質(zhì)-紋狀體腦片的細(xì)胞大量死亡，但與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)7天，腦片周圍神經(jīng)軸突生長增多，腦片中的細(xì)胞死亡減少、超微結(jié)構(gòu)損傷減輕、表達(dá)TH的陽性細(xì)胞數(shù)目增多(p＜0.05)。MPP+損傷的

7、腦片組織中的多巴胺含量與正常組和聯(lián)合培養(yǎng)組相比明顯減少(p＜0.01)，前者培液中的3，4-二羥苯乙酸和高香草酸水平也顯著減少(p＜0.05)，但聯(lián)合培養(yǎng)組與正常組相比上述物質(zhì)無顯著差異。 結(jié)論：MSCs在體外能促進(jìn)受損的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元存活，可望用于帕金森病的移植治療。 第三部分超順磁氧化鐵標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療 帕金森模型鼠的實驗研究 目的：觀察移植的MSCs在PD模型鼠腦內(nèi)的遷移及分化，探討

8、MSCs移植治療PD的可能性。研究應(yīng)用超順磁氧化鐵(SPIO)和BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植治療帕金森病(PD)大鼠的活體MRI觀察及組織學(xué)觀察。 方法：分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，一組MSCs用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行SPIO標(biāo)記，另一組MSCs用BrdU標(biāo)記；制作PD大鼠模型，將不同標(biāo)記的MSCs分別移植到PD大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)，利用阿樸嗎啡觀察PD鼠的行為學(xué)變化，采用MRI在體觀察腦內(nèi)移植的MSCs存活和遷徙情況

9、。應(yīng)用透射電鏡和免疫熒光雙標(biāo)法觀察移植后的MSCs增殖和分化。 結(jié)果：體外SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為普魯氏藍(lán)染色陽性；對移植了SPIO標(biāo)記MSCs的PD大鼠行磁共振檢查，T2和T2GRE掃描在移植區(qū)呈低信號改變，隨時問的延長，移植區(qū)信號向周圍擴大，但信號減弱。普魯氏藍(lán)染色顯示腦紋狀體區(qū)SPIO標(biāo)記的MSCs從移植部位向四周遷移。電鏡顯示，SPIO標(biāo)記的MSCs呈類神經(jīng)元形態(tài)。免疫熒光組化結(jié)果表明，MSCs移植后4周，在移植