轉(zhuǎn)染hTERT基因促進(jìn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)轉(zhuǎn)染人端粒酶催化亞單位hTERT促進(jìn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（human corneal endothelial cells，HCECs）增殖，為構(gòu)建組織工程化生物角膜提供種子細(xì)胞。 方法：解剖顯微鏡下撕取人角膜后彈力層，反復(fù)剪碎，采用Ⅳ型膠原酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法獲取角膜內(nèi)皮細(xì)胞，以1×105/ml接種在12孔板上。采用DF99培養(yǎng)液（DMEM/F12與M199培養(yǎng)液按照1：1的比例混合）培養(yǎng)原代人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（primary

2、human corneal endothelial cells，PHCEn）。PHCEn生長(zhǎng)到80％融合時(shí)，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pEGFP—N1轉(zhuǎn)染到PHCEn，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率：pBABE—puro—hTERT轉(zhuǎn)染到PHCEn，1μg/ml嘌呤霉素篩選，RT—PCR、Western blot鑒定端粒酶表達(dá)情況。對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)光鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；MTT法和細(xì)胞周期檢

3、測(cè)比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞（hTCEn）與PHCEn生長(zhǎng)增殖能力；RT—PCR檢測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞分泌因子CollagenⅧ和離子通道相關(guān)基因VDAC3、SLC4A4、CLCN3和Na+/K+ ATPase的表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)hTCEn特異性標(biāo)志蛋白NSE、中問(wèn)絲Vimentin、微管蛋白β—tubulin、微絲蛋白F—actin的表達(dá)。 結(jié)果：在體外PHCEn只能傳3代，hTCEn已經(jīng)傳到20代，細(xì)胞仍然保持典型的鵝卵石樣外觀；表達(dá)端粒酶