pEGFP-bFGF基因轉(zhuǎn)染人角膜緣干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 研究pEGFP-bFGF基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人角膜緣干細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后對(duì)NaOH損傷的抵抗作用，探討從基因水平上治療眼表疾病的可行性，為基因工程技術(shù)和干細(xì)胞移植結(jié)合治療眼表疾病提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究分為三部分： 實(shí)驗(yàn)一：人角膜緣干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 實(shí)驗(yàn)二：pEGFP-bFGF基因轉(zhuǎn)染人角膜緣干細(xì)胞及其表達(dá)的觀察 實(shí)驗(yàn)三：轉(zhuǎn)染后的人角膜緣干細(xì)胞對(duì)NaOH損傷的抵抗作用 方法

2、 實(shí)驗(yàn)一：無(wú)菌條件下取新鮮尸眼眼球，剖取淺層角膜緣上皮組織，按組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察不同階段培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)，HE染色光鏡下觀察細(xì)胞，MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。制備HLSCs細(xì)胞爬片，用AE5作陰性標(biāo)志檢測(cè)角質(zhì)蛋白K3／K12的表達(dá)以鑒定HLSCs，制備傳代細(xì)胞爬片作陽(yáng)性對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)二：借助真核表達(dá)載體(pEGFP-C1)，采用脂質(zhì)體 (Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染法，將bFG

3、F基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HLSCs，在熒光顯微鏡下觀察其表達(dá)情況，并繼續(xù)培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)三：制作NaOH細(xì)胞損傷模型，每O．1ml細(xì)胞培養(yǎng)基中加1ul0．05mol／LNaOH，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)m，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組(Normal)和基因轉(zhuǎn)染組(bFGF)，未轉(zhuǎn)染損傷組(NaOH)和轉(zhuǎn)染損傷組(bFGF+NaOH)。用MTT法檢測(cè)每組細(xì)胞存活狀況及激光共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡及壞死情況。

4、結(jié)果 實(shí)驗(yàn)一：體外成功培養(yǎng)原代HLSCs，并傳到第5代，其中原代與1—3代細(xì)胞生長(zhǎng)良好，活細(xì)胞百分比分別為99％、97．8％、96．5％、95％，而3代以后細(xì)胞的活性較差，活細(xì)胞百分比分別為90％與83％。免疫熒光顯微鏡下觀察AE5在HLSCs原代爬片的細(xì)胞胞漿中呈陰性表達(dá)，而在傳代細(xì)胞爬片的細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：成功將pEGFP-bFGF基因轉(zhuǎn)染HLSCs，48h后熒光顯微鏡下可見(jiàn)特異性的綠色熒光，基因轉(zhuǎn)染率

5、為20-30％，轉(zhuǎn)染第7天仍可見(jiàn)熒光表達(dá)，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光。轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，并均在1w后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞百分比分別為96．4％與96．7％。 實(shí)驗(yàn)三： 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活狀況： bFGF組細(xì)胞存活率略高于Normal組，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)；Normal組細(xì)胞存活率明顯高于NaOH組，差別有顯著性(p<0．05)；bFGF+NaOH組細(xì)胞存活率高于NaOH組，差別

6、有顯著性(p<0．05)。 2、LSCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡及死亡情況： bFGF組和Normal組細(xì)胞凋亡率加壞死率分別為12．5％和¨．3％，差別無(wú)顯著性(p>0．001)；而NaOH組細(xì)胞凋亡加壞死率為88％，高于Normal組，差別顯著(p<0．001)。bFGF+NaOH組細(xì)胞凋亡及壞死率為73．6％。bFGF+NaOH組與NaOH組相比較，凋亡率加壞死率相差14．4％。差別有顯著性(p<0．001)。 結(jié)論

7、 1、體外利用組織塊法能夠成功培養(yǎng)出HLSCs并傳代，隨著細(xì)胞的傳代細(xì)胞增殖能力減弱，繼續(xù)傳代能力差。原代細(xì)胞AE5表達(dá)陰性，說(shuō)明細(xì)胞可能為原始的干細(xì)胞；而細(xì)胞傳代后已分化，AE5表達(dá)陽(yáng)性。 2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠?qū)EGFP-bFGF基因轉(zhuǎn)染HLSCs并得到表達(dá)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，說(shuō)明應(yīng)用基因工程，通過(guò)載體能將外源性基因轉(zhuǎn)染HLSCs并且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。 3、被bFGF基因轉(zhuǎn)染的HLSCs能夠減輕NaO