人內皮抑素基因轉染治療肝細胞性肝癌的實驗研究.pdf

1、浙江大學博士學位論文人內皮抑素基因轉染治療肝細胞性肝癌的實驗研究姓名：劉宏申請學位級別：博士專業(yè)：普通外科學指導教師：彭承宏20050201浙江大學博L學位論文入宿主細胞，在腫瘤周圍產生有活性的內皮抑素，達到治療腫瘤的目的。有研究表明利用病毒載體進行抗血管生成治療能有效抑制鼠移植瘤模型的生長。腺相關病毒是其中最重要的一種載體，因為它具如卜特點：沒有致病性；不會引起免疫反應；轉染效率高；能夠轉染未分化細胞；宿主細胞范圍廣：能將目的基因定位

2、整合入宿主細胞染色體，并長期、穩(wěn)定表達。有研究發(fā)現(xiàn)腺相關病毒皮下注射后可以在肝細胞中集聚，提示它具有嗜肝性。在本研究中我們構建了含人內皮抑素基因的重組腺相關病毒載體，探討腺相關病毒介導的內皮抑素基因轉染對肝細胞性肝癌的抑制作用，實驗共分三個部分第一部分：人內皮抑素基因克隆和重組腺相關病毒構建根據(jù)genebank中的人內皮抑素序列設計引物，在上游引物中插入EcoRI酶切位點，在下游引物中插入SalI酶切位點，運用RTPCR方法從新鮮人肝組

3、織中擴增內皮抑素基因(hEN)，克隆到pUCl9載體上，進行酶切鑒定和全自動正反向測序。用限制性內切酶EcoRI和SalI消化腺相關病毒質粒pSNAV，將其與hEN連接，構建含目的基因的2型重組腺相關病毒質粒pSNAV—hEN，pSNAV—hEN的病毒包裝由中國預防科學院病毒研究所協(xié)助完成，產物被命名為rAAV2一hEN，病毒滴度為110“vg／ml，為了檢測腺相關病毒的轉染效率，同時合成含報告基因的重組腺相關病毒rAAV2一EGFP—

4、hEN。第二部分：重組腺相關病毒體外轉染肝癌細胞的實驗研究rAAV2一EGFP—hEN轉染人肝癌細胞系Hep3B，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白，流式細胞儀檢測顯示當多重感染劑量(MOI)值為1106vg／cell時，表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)達到峰值，約為6248％。將rAAV2一hEN按最適MOI轉染肝癌細胞，RT—PCR結果證實轉染細胞在mRNA水平高表達內皮抑素；另外，轉染細胞濃縮上清的SDS—PAGE電泳中也檢測到了約22KD的特

5、異性蛋白條帶，提示腺相關病毒可介導內皮抑素基因高效轉染肝癌細胞，并表達內皮抑素蛋白。通過MTT法檢測內皮抑素對內皮細胞增殖的抑制作用，用轉染細胞的培養(yǎng)液上清處理人臍靜脈內皮細胞(ECV304)24h、48h、72h，檢測發(fā)現(xiàn)內皮抑素轉染組的光密度值明顯低于空病毒組和空白對照組(p3305)，而空病毒組和空白對照組之間無顯著差異，提示轉染細胞分泌的內皮抑素抑制了ECV304細胞的增殖。流式細胞分析顯示轉染細胞培養(yǎng)液上清處理72h的內皮細胞