人內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染治療肝細(xì)胞性肝癌的實驗研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文人內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染治療肝細(xì)胞性肝癌的實驗研究姓名：劉宏申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：普通外科學(xué)指導(dǎo)教師：彭承宏20050201浙江大學(xué)博L學(xué)位論文入宿主細(xì)胞，在腫瘤周圍產(chǎn)生有活性的內(nèi)皮抑素，達(dá)到治療腫瘤的目的。有研究表明利用病毒載體進(jìn)行抗血管生成治療能有效抑制鼠移植瘤模型的生長。腺相關(guān)病毒是其中最重要的一種載體，因為它具如卜特點：沒有致病性；不會引起免疫反應(yīng)；轉(zhuǎn)染效率高；能夠轉(zhuǎn)染未分化細(xì)胞；宿主細(xì)胞范圍廣：能將目的基因定位

2、整合入宿主細(xì)胞染色體，并長期、穩(wěn)定表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)腺相關(guān)病毒皮下注射后可以在肝細(xì)胞中集聚，提示它具有嗜肝性。在本研究中我們構(gòu)建了含人內(nèi)皮抑素基因的重組腺相關(guān)病毒載體，探討腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染對肝細(xì)胞性肝癌的抑制作用，實驗共分三個部分第一部分：人內(nèi)皮抑素基因克隆和重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建根據(jù)genebank中的人內(nèi)皮抑素序列設(shè)計引物，在上游引物中插入EcoRI酶切位點，在下游引物中插入SalI酶切位點，運用RTPCR方法從新鮮人肝組

3、織中擴(kuò)增內(nèi)皮抑素基因(hEN)，克隆到pUCl9載體上，進(jìn)行酶切鑒定和全自動正反向測序。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI消化腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pSNAV，將其與hEN連接，構(gòu)建含目的基因的2型重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pSNAV—hEN，pSNAV—hEN的病毒包裝由中國預(yù)防科學(xué)院病毒研究所協(xié)助完成，產(chǎn)物被命名為rAAV2一hEN，病毒滴度為110“vg／ml，為了檢測腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)染效率，同時合成含報告基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV2一EGFP—

4、hEN。第二部分：重組腺相關(guān)病毒體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的實驗研究rAAV2一EGFP—hEN轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Hep3B，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白，流式細(xì)胞儀檢測顯示當(dāng)多重感染劑量(MOI)值為1106vg／cell時，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，約為6248％。將rAAV2一hEN按最適MOI轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，RT—PCR結(jié)果證實轉(zhuǎn)染細(xì)胞在mRNA水平高表達(dá)內(nèi)皮抑素；另外，轉(zhuǎn)染細(xì)胞濃縮上清的SDS—PAGE電泳中也檢測到了約22KD的特

5、異性蛋白條帶，提示腺相關(guān)病毒可介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因高效轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并表達(dá)內(nèi)皮抑素蛋白。通過MTT法檢測內(nèi)皮抑素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液上清處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)24h、48h、72h，檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素轉(zhuǎn)染組的光密度值明顯低于空病毒組和空白對照組(p3305)，而空病毒組和空白對照組之間無顯著差異，提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的內(nèi)皮抑素抑制了ECV304細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞分析顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液上清處理72h的內(nèi)皮細(xì)胞