uPA和VEGF165單基因真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞對細胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和人血管內(nèi)皮細胞生長因子165(VEGF165)單基因真核表達質(zhì)粒,并將 uPA和 VEGF165單基因真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),檢測其轉(zhuǎn)染后 uPA、VEGF165的表達及對細胞增殖的影響。
　　方法:
　　1. uPA和VEGF165單基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計帶酶切位點的PCR引物以及合成引物;常規(guī)培養(yǎng)HUVECs,提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成c

2、DNA;通過PCR對VEGF165及uPA基因片段擴增并引入新的酶切位點;將其分別定向連入真核表達載體pIRES2-EGFP,構(gòu)建表達目的基因的單順反子,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞。通過PCR、酶切分析及 DNA序列測定鑒定重組質(zhì)粒pIRES2/EGFP-VEGF165和pIRES2/EGFP-uPA。
　　2.重組質(zhì)粒擴增后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞,分組為A組(PBS空白對照)、B(空載質(zhì)粒pIRES2/EGFP轉(zhuǎn)染陰性對照

3、)、C(pIRES2/EGFP-uPA+ pIRES2/EGFP共轉(zhuǎn)染)、D組(pIRES2/EGFP-VEGF165+ pIRES2/EGFP共轉(zhuǎn)染)、E組(pIRES2/EGFP-VEGF165+ pIRES2/EGFP-uPA共轉(zhuǎn)染)。通過MTT比色法檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力,描畫細胞生長曲線,實時熒光定量PCR(QPCR)檢測各組細胞uPA及VEGF165 mRNA相對含量,Western blot檢測uPA及VEGF165的

4、蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1. pIRES2/EGFP-uPA和鑒定pIRES2/EGFP-VEGF165:重組質(zhì)粒作XhoI和SalI雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見VEGF165條帶和uPA條帶,酶切條帶與聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳帶處于相同位置。DNA序列測定證實,目的基因插入片段方向正確,序列無突變。
　　2.轉(zhuǎn)染pIRES2/EGFP-uPA和pIRES2/EGFP-VEGF165,MTT檢測結(jié)果提示E組細胞增殖速率

5、高于較A、C、B組,差異有顯著性(P<0.05); E組與D組比較,差異無顯著性(P>0.05)。QPCR提示E組uPA基因相對表達量高于A、B、D組,差異有顯著性(P<0.05);E組與C組比較,差異無顯著性(P>0.05);E組VEGF165基因相對表達量高于較A、B、C組,差異有顯著性(P<0.05);E組與D組比較,差異無顯著性(P>0.05)。Western blot檢測表明C、E組uPA蛋白表達量高于A、B、D組,C、E組之

6、間uPA蛋白表達未見明顯差異,D組uPA蛋白表達量高于A、B組,A、B組表達少量uPA;D、E組VEGF165蛋白表達量高于A、B、C組。
　　結(jié)論:
　　1.uPA和 VEGF165單基因真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞后目的基因 uPA和 VEGF165有效表達,細胞增殖速率明顯加強;
　　2.在細胞內(nèi)上調(diào) VEGF165能促進 uPA的表達;
　　3.本實驗為轉(zhuǎn)染 VEGF165和 uPA治療靜脈血栓性疾