膜莢黃芪和大豆苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及在畢赤酵母中的分泌表達.pdf

1、L-苯丙氨酸（L-phenylalanine），作為人體必需的氨基酸之一，在食品工業(yè)中，主要用作新型食品添加劑阿斯巴甜（Aspartame，L-Asp-L-Phe-Me）的合成原料。隨著世界市場每年對阿斯巴甜需求量的增加，L-Phe的合成工藝已成為當(dāng)前生物化工領(lǐng)域研究與開發(fā)的熱點。利用苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL，E.C.4.3.1.5）的逆向催化特性來生產(chǎn)L-Phe是一條主要的路線，關(guān)鍵

2、問題在于怎樣低成本而又高效地獲得苯丙氨酸解氨酶PAL。本研究在畢赤酵母GS115和大腸桿菌BL21中構(gòu)建了PAL基因工程菌，期望通過微生物發(fā)酵實現(xiàn)苯丙氨酸解氨酶PAL的工業(yè)化生產(chǎn)。研究結(jié)果如下:
　　1)克隆到了來自膜英黃芪和大豆的PAL基因的ORF。
　　2)構(gòu)建了克隆載體pUCm-T-PAL并轉(zhuǎn)化到了大腸桿菌DH5α中。
　　3)PAL基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果。
　　利用DNAStar軟件和NCBI對測序序列

3、進行分析，結(jié)果如下:來自于膜英黃芪的基因ORF長度為2157bp，編碼718個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為78KD，等電點為6.04，所擴增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均與膜莢黃芪苯丙氨酸解氨酶EF567076.1有99％的一致性;來自于大豆的基因ORF長度為2142bp，編碼713個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為77.6KD，等電點為6.31，所擴增到的基因其核酸序列及氨基酸序列均與大豆苯丙氨酸解氨酶AK245610.1有100％的一致性

4、。
　　4)利用體外同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達載體pPIC9K-AmPAL, pPIC9K-GmPAL和pET32a-AmPAL。
　　5)獲得了基因工程菌GS115-pPIC9K-AmPAL，GS115-pPIC9K-GmPAL和BL21-pET32a-AmPAL。
　　基因工程菌誘導(dǎo)表達后，對其產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如下:①重組菌BL21-pET32a-AmPAL與負(fù)對照相比，25℃時，1mmoL/L IPTG誘導(dǎo)1h后，

5、其SDS-PAGE電泳圖譜在96kD(包括載體上部分氨基酸序列)處有一條明顯的特異性蛋白條帶，大小與預(yù)期PAL蛋白一致，但是酶活性不高，只有5U;②重組菌GS115-pPIC9K-AmPAL，1％甲醇誘導(dǎo)48h后，其SDS-PAGE電泳圖譜在78KD位置處出現(xiàn)一條特異性條帶，其大小與預(yù)期值一致，并且隨著誘導(dǎo)時間增加，PAL表達量越來越大，誘導(dǎo)120h后，表達量達到最大。利用Q-Sepharose FF蛋白純化柱對總蛋白進行純化，獲得了較