山西地區(qū)苯丙氨酸羥化酶基因突變實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　85例患兒均來(lái)自山西省婦幼保健院新生兒篩查中心和門診、大同市婦幼保健院、長(zhǎng)治市婦幼保健院、運(yùn)城市婦幼保健院門診經(jīng)過(guò)各種檢查后確診為苯丙酮尿癥的患兒。年齡均在15天至7歲之間，其中48例為男性,37例為女性。初診時(shí)外周血苯丙氨酸濃度測(cè)定均在251-2621μmol/L，所有患兒在獲得了患兒家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人的知情同意的情況下均進(jìn)行了血二氫喋啶還原測(cè)定、尿喋呤分析和四氫生物喋呤缺乏癥負(fù)荷試驗(yàn)，將四氫生物喋呤缺乏癥排除掉。苯丙酮尿

2、癥（phenylketonuria， PKU; OMIM261600）是可以治愈的少數(shù)遺傳病之一，在我國(guó)的發(fā)病率約為1/11572，大部分患者是由于PAH基因突變，導(dǎo)致 PAH酶活性降低或消失，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化而在體內(nèi)大量積蓄，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)苯丙酮尿癥的診斷方法耗時(shí)長(zhǎng)且相當(dāng)繁瑣，且這些方法僅適用于已經(jīng)出生患兒的診斷，不能應(yīng)用于產(chǎn)前篩查。因此，通過(guò)對(duì)山西地區(qū)PKU患者中PAH基因的突變位點(diǎn)及特征的研究，探討PKU基因

3、診斷和產(chǎn)前篩查的方法，并能夠進(jìn)一步豐富中國(guó)人PAH基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　方法:
　　1、收集山西地區(qū)各醫(yī)院確診為PKU的患兒標(biāo)本85例，用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)對(duì)苯丙酮尿癥患者的第3、7和11號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切突變位點(diǎn)分析；
　　2、采用高分辨熔解曲線分析（High Resolution Melting，HRM）法檢測(cè)PKU患兒的5、6、7`、11和12號(hào)外顯子的常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。
　　3、對(duì)

4、85例PKU患兒 PAH基因13個(gè)外顯子進(jìn)行體外擴(kuò)增和測(cè)序，然后與正常序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)全部突變信息。
　　結(jié)果:
　　1、采用 PCR-RFLP，對(duì)85例 PKU患兒中PAH基因第3、7和11外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，兩者結(jié)果相符；
　　2、本研究中，我們采用HRM法作為篩查工具，對(duì)85例 PKU患者進(jìn)行了PAH基因的5、6、7、11和12外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的突變篩查，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，PCR-HRM產(chǎn)物

5、的檢測(cè)結(jié)果與第5、6、7、11和12外顯子 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果完全吻合。
　　3、對(duì)85例患者PAH基因13個(gè)外顯子進(jìn)行序列分析，其中，L11fsX7、P69H、L98V、T372R和IVS11-1G>C五個(gè)突變位點(diǎn)在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未報(bào)到，并得出R243Q、V399V和 Y204C屬于山西地區(qū)的突變熱點(diǎn)；
　　結(jié)論:
　　1、PCR-RFLP法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高和低成本的特點(diǎn)，為基層開(kāi)展 PAH基因檢

6、測(cè)提供了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法；
　　2、HRM技術(shù)具有高準(zhǔn)確度、高通量、低成本的特點(diǎn)，適用于 PAH基因的常見(jiàn)突變位點(diǎn)篩查，也可用于新生兒PAH基因的產(chǎn)前診斷；
　　3、通過(guò)對(duì)山西地區(qū)85例PKU患兒 PAH基因的13個(gè)外顯子突變分析，結(jié)果顯示，患有苯丙氨酸缺乏癥的患者中突變頻率最高的位點(diǎn)是R243Q，為15.8％，其次為V399V和Y204C。L11fsX7、P69H、L98V、T372R和IVS11-1G>C五個(gè)突變位